Animal test alternatives in metal toxicology research. A study by

Abstract

En esta Tesis se han utilizado diferentes modelos de toxicidad in vitro para estudiar los efectos citotóxicos inducidos por metales. Se han usado cuatro líneas celulares, HaCat, PC12, ES D3 y BALB/3T3, como modelos de dermotoxicidad, neurotoxicidad, embriotoxicidad y carcinogénesis y se han llevado a cabo los siguientes estudios:<br/>- HaCat<br/>a) Determinación de la toxicidad inducida por compuestos de platino ((NH4)2PtCl6, PtCl2, y PtCl4) mediante la medida de la eficiencia en la formación de colonias (CFE). PtCl2 y (NH4)2PtCl6 mostraron un efecto citotóxico mayor que PtCl4 y (NH4)2PtCl4. Las respuestas citotóxicas de los compuestos de platino resultaron dependientes del tiempo de exposición y de la forma química del elemento.<br/>b) Estudio del efecto citotóxico inducido por 51 metales a una concentración fija de 100 mM durante 72 horas. Este ensayo permitió clasificar las especies de metales en tres grupos según el grado de la respuesta citotóxica obtenida.<br/>- PC12<br/>Estudio del efecto citotóxico inducido por 24 metales a una concentración fija de 100 mM durante 24 y 72 horas de exposición y utilizando el MTT como ensayo de citotoxicidad. Los experimentos se llevaron a cabo en células cultivadas en ausencia o presencia de tetraciclina, en modo de favorecer (Tet-on) o impedir (Tet-off) la expresion de la p53. Los metales que afectaron la viabilidad celular fueron Ag, As, Cd, Cr, Pt, Se, y Te.<br/>- ES D3<br/>Estudio del efecto inducido por metilmercurio en la frecuencia de latido de las células ES. La citotoxicidad del compuesto metálico se evaluó durante la primera fase de diferenciación.<br/>- BALB/3T3<br/>Estudio del potencial citotóxico y carcinogénico de especies orgánicas e inorgánicas de arsénico. A diferencia de NaAsO2 y Na2HAsO4, las formas orgánicas, arsenobetaina y arsenocolina, no produjeron efectos citotóxicos en las células. Sólo las especies inorgánicas de As dieron resultados positivos en el ensayo morfológico de transformación celular. Estos resultados confirman, por una parte, que los compuestos inórganicos de As son biológicamente más activos que los orgánicos y, por otra, la importancia fundamental de la especiación en la respuesta toxicológica.

The present research concerns the use of in vitro toxicity testing methods for studying the cytotoxic effects of metal compounds induced in four different cell lines such as HaCaT, PC12, ES D3 and BALB/3T3 as models of dermal toxicity, neurotoxicity, embryotoxicity and carcinogenic potential of xenobiotics. The following studies have been carried out:<br/>- HaCaT<br/>a) Determination of cytoxicity of Pt compounds ((NH4)2PtCl4, (NH4)2PtCl6, PtCl2 and PtCl4) as measured by Colony Forming Efficiency (CFE). PtCl2 and (NH4)2PtCl6 were more cytotoxic compared to PtCl4 and (NH4)2PtCl4. The cytotoxic responses of the four platimun species was dependent of the time of exposure and on the chemical form of the element.<br/>b) Screening test of the cytotoxic induced by 100 mM of 51 metal compounds at 72h post-exposure. This allowed a classification of the metal species tested as 3 groups according to the severity of the degree of their cytotoxic response.<br/>- PC12<br/>Screening test on the cytotoxic response in relation to the exposure to 100 mM of 24 metal compounds for 24h and 72h as determined by MMT test. The study has been carried out on cells that were grown in absence or presence of tetracycline, a technique that makes (Tet-on) or not (Tet-off) possible the expression p53 gene.<br/>Metal compounds which affect cell viability are Ag, As, Cd, Cr, Pt, Se and Te.<br/>- ES D3<br/>Effect of methyl mercury on the beating of ES cells, Cytotoxic effect of the metal compound was observed during the first step of differentiation.<br/>- BALB/3T3<br/>Inorganic and organoarsenic species have been studied for their cytotoxic and carcinogenic potential. Unlike NaAsO2 and Na2HAsO4 the organoarsenic forms arsenobetaine and arsenocholine failed to induce any significant cytotoxic effect in the cells, the inorganic As species (but not the organic ones) giving positive results in the morphological neoplastic transformation assay. These findings confirm that inorganic As compounds are biologically more active compared to organoarsenic species, and the great importance of the speciation as fundamental factor in determining the toxicological response.