Determinación de la sensibilidad a los antivíricos de las cepas de herpesvirus aisladas de muestras clínicas. Puesta a punto y evaluación de las técnicas

Abstract

Objetivos: Puesta a punto de la técnica de reducción del número de placas (PRA), para estudiar la sensibilidad in vitro al ganciclovir (GCV) y al foscarnet (FOS) de las cepas de herpesvirus humano tipo 5 (HHV-5) y al aciclovir (ACV) y al FOS de las cepas de herpesvirus humano tipo 3 (HHV-3). Puesta a punto de las técnicas de reducción del efecto citopático (REC) y de coloración vital (DUA), para estudiar la sensibilidad in vitro al ACV y al FOS de las cepas de herpesvirus humanos tipos 1 y 2 (HHV-1 y HHV-2). Análisis de los valores de sensibilidad a los antivíricos de las cepas de HHV-1, 2 y 5 y comparación con la evolución clínica de los pacientes tras el tratamiento. Material y métodos: Se ha estudiado la sensibilidad de 204 cepas de HHV-1 y 2 aisladas de diferentes muestras de 165 pacientes inmunodeprimidos. Los valores de sensibilidad al antivírico se expresan como dosis inhibitoria 50% (DI50) y se calculan mediante el método de Spearman-Kärber cuando la técnica utilizada es la de REC y estadísticamente, mediante una estimación lineal, cuando se utiliza la de DUA. Asimismo, se ha estudiado la sensibilidad de 80 cepas de HHV-5 aisladas de las muestras de 73 pacientes con o sin patología de base y de nueve cepas de HHV-3 aisladas de las muestras tomadas de lesiones cutáneas de nueve pacientes. Los valores de DI50 se calculan mediante el método de Reed-Muench modificado. <br/>Resultados: El 96% de las cepas de HHV-1 y 2 estudiadas fueron sensibles a valores de DI50 del ACV inferiores a 3 mg/ml y todas fueron sensibles a valores de DI50 del FOS inferiores a 200 mg/ml. El 98% de cepas de HHV-5 fueron sensibles a valores de DI50 de GCV inferiores a 12 mM e inferiores a 400 mM en el caso del FOS. Todas las cepas de HHV-3 fueron sensibles tanto al ACV como al FOS.<br/>Conclusiones: 1 - La técnica de REC es sencilla y útil para estudiar la sensibilidad de los HHV-1 y 2.<br/>2 - La técnica de REC presenta una reproducibilidad del 87%. 3 - La adición de colorante vital en la técnica de REC añade complejidad a la técnica. 4 - Los valores obtenidos con las técnicas de REC y de PRA correlacionan con la evolución clínica de los pacientes. 5 - La frecuencia de HHV-1 y 2 resistentes al ACV en pacientes inmunodeprimidos es baja (4%) y cuando se observa no es necesariamente indicativa de fallo terapéutico. 6 - La técnica de PRA para el estudio de la sensibilidad de los HHV-5 y 3 es sencilla y requiere entre seis y ocho semanas lo que limita parcialmente su utilidad clínica.7 - La frecuencia de cepas de HHV-5 resistentes in vitro al GCV (4%) y al FOS (4%) en pacientes no tratados previamente es baja. 8 - No se detectó ninguna cepa de HHV-3 resistente al ACV o al FOS. 9 - Nuestra experiencia confirma que no es necesaria la realización de estudios de sensibilidad de los herpesvirus de forma rutinaria. Estos estudios estarían indicados en las cepas aisladas de pacientes con alteraciones inmunológicas graves cuyas lesiones siguen evolucionando o empeoran estando en tratamiento con el antivírico.

Objectives: Standarize the plaque reduction assay (PRA), to study in vitro susceptibility to ganciclovir (GCV) and foscarnet (FOS) of human herpesvirus type 5 (HHV-5) strains and to aciclovir (ACV) and FOS of human herpesvirus type 3 (HHV-3) strains. Standarize the cytopathic effect reduction assay (CRA) and the dye-uptake assay (DUA), to study in vitro susceptibility to ACV and FOS of human herpesvirus types 1 and 2 (HHV-1 and HHV-2) strains. Analize the antiviral susceptibility values obtained with the HHV-1, 2 and 5 strains to compare with the clinical evolution of the patients after treatment. Material and methods: We studied the susceptibility of 204 HHV-1 y 2 strains isolated from different samples isolated from 165 immunosuppressed patients. Antiviral susceptibility values are expressed as the 50 per cent inhibitory dose (ID50). When the antiviral susceptibility was determined by CRA we used the Spearman-Kärber method to calculate the ID50 and with the DUA we determined this value, statistically, using a linear stimation. We studied the susceptibility of 80 HHV-5 strains isolated from the samples of 73 patients with o without underlying disease. Finally, we studied the susceptibility of nine HHV-3 strains isolated from the samples recovered from the skin lesions of nine patients. The ID50 values were determined using the Reed-Muench modified method. <br/>Results: Approximately 96% of HHV-1 and 2 strains were inhibited by ACV ID50 values lower than 3 mg/ml. All the strains were susceptible to FOS ID50 values lower than 200 mg/ml. Ninety eight per cent of HHV-5 strains were inhibited by GCV ID50 values lower than 12 mM and by FOS ID50 values lower than 400 mM. All the HHV-3 strains were susceptible to ACV and FOS.<br/>Conclusions: 1 - The CRA is easy to perform and can be used to study the susceptibility of HHV-1 and 2. 2 - The reproducibility of the CRA is about 87%. 3 - The addition of vital dye to the CRA adds complexity to this assay. 4 - The values obtained with CRA and PRA had a close correlation with the clinical outcome of patients. 5 - The frequency of HHV-1 and 2 resistant to ACV in immunosuppressed patients is low (4%) and when it's observed not necessarily indicates therapeutic failure. 6 - The PRA is easy to perform the study of susceptibility of HHV-5 and 3 and needs between six and eight weeks to obtain results limiting parcially its clinical utility. 7 - The frequency of HHV-5 strains in vitro resistant to GCV (4%) and to FOS (4%) is low in patients no treated previously. 8 - We didn't detect any HHV-3 strain resistant to ACV or to FOS. 9 - In our experience, there is no need to routinely test susceptibility of HHV-1 and 2 isolated to ACV. Study of HHV-1 and 2 susceptibility should be indicated only in viruses isolated from patients with a severe immunologic disturbance in whom lesions persist or worsen while on ACV therapy.