Importancia de los metaloreguladores fur y zur en la virulencia de Samonella typhimurium

Abstract

El eje central de la presente Tesis Doctoral ha sido la conexión existente entre la capacidad infectiva de Salmonella typhimurium y el mantenimiento de sus concentraciones intracelulares óptimas de hierro y zinc. <br/>El estudio de la relación entre el hierro y la virulencia se realizó mediante la construcción y caracterización de un mutante fur. La proteína Fur es el regulador de los sistemas vinculados con la captación, transporte y almacenamiento de este elemento. La desregulación de estos sistemas en la cepa mutante provoca el aumento de la concentración intracelular de Fe2+ libre, lo que incrementa la actividad de algunas enzimas como la 3',5'-cAMP fosfodiesterasa codificada por el gen cpdA. Este hecho determina una disminución de la concentración de cAMP intracelular y, por consiguiente, una reducción de aquellos genes y regulones que están bajo el control del complejo CRP-cAMP, entre los que se encuentra el sistema de síntesis y ensamblaje de flagelos. Así mismo, se ha demostrado que existe una vinculación adicional entre la proteína Fur y la síntesis flagelar a través del control por parte de ésta del promotor flhDC, conocido también como master operon, y que se encuentra en la cúspide de la cascada de activación de todo el regulón. La reducción de la concentración intracelular de cAMP puede ser la causa de la menor virulencia de los mutantes fur cuando son inoculados intraperitonealmente en ratones BALB/c o Swiss.<br/>La vinculación entre el zinc y la capacidad infectiva de S. typhimurium se abordó mediante la construcción de mutantes que tuvieran afectado el gen zur, que codifica el regulador transcripcional relacionado con este elemento, o el gen znuC, que forma parte de un sistema de transporte de alta afinidad. En el primer caso, cuando los sistemas de transporte de zinc de la cepa mutante están desregulados, se observa un ligero descenso de la capacidad infectiva cuando se inocula por vía intraperitoneal dicho mutante en ratones BALB/c. Sin embargo, es la inactivación del sistema de alta afinidad la que comporta una reducción más drástica de la virulencia de la cepa cuando se inocula ya sea por vía oral o intraperitoneal en el huésped. De acuerdo con estos datos, la cepa ZnuC- es excluida por la salvaje a lo largo del proceso infectivo cuando se lleva a cabo una inoculación conjunta con ambas.<br/> Finalmente, y mediante la construcción de una cepa mutS de S. typhimurium así como de otra portadora de un plásmido con los genes umuDC de Escherichia coli, se ha comprobado que el incremento de la frecuencia de mutagénesis, tanto espontánea como inducida, no confiere una ventaja selectiva a lo largo del proceso infectivo. En concordancia con ello, también se ha podido constatar que el DNA de las células de S. typhimurium no sufre un nivel de lesiones lo suficientemente elevado como para inducir el sistema de reparación de emergencia durante la infección.<br/><br/>Los artículos que se adjuntan en los anexos I, II y III de la presente memoria de Tesis Doctoral contienen los resultados en los que se basa este trabajo.<br/><br/><br/>Anexo I: Campoy, S., A. M. Pérez de Rozas, J. Barbé e I. Badiola. 2000. Virulence and mutation rates of Salmonella typhimurium strains with increased mutagenic strength in a mouse model. FEMS Microbiol. Lett. 187:145-150<br/><br/>Anexo II: Campoy, S., M. Jara, N. Busquets, A. M. Pérez de Rozas, I. Badiola y J. Barbé. 2002. Intracellular cyclic AMP concentration in decreased in Salmonella typhimurium fur mutants. Microbiology 148:1039-1048<br/><br/>Anexo III: Campoy, S., M. Jara, N. Busquets, A. M. Pérez de Rozas, I. Badiola y J. Barbé. 2002. Role of the high-affinity zinc uptake znuABC system in Salmonella enterica serovar Typhimurium virulence. Infect. Immun. 70:4721-4725.

In this work we pretend to elucidate the relation that could be established between Salmonella typhimurium virulence and the zinc or iron intracellular concentrations.<br/>The Fur protein is involved in either iron-uptake or iron-storage regulation. In a fur mutant these systems are deregulated, giving raise an increased free Fe2+ concentration. In this situation the enzymic activity of some proteins like 3',5'- cAMP phosphodiesterase, encoded by cpdA gene, may be stimulated, decreasing the fur mutant final cAMP intracellular concentration. This lower cAMP level altered the expression of all the genes that are under the CRP-cAMP regulation like flagellar system. In this work, we also demonstrate that there is a direct relationship between Fur protein and the flagellar synthesis, in fact, Fur can regulate this system by controlling the expression of flhDC operon, also called master operon, which is the starting point of all the activation cascade.<br/>The reduction of the cAMP intracellular concentration could be the responsible of the lower fur mutants virulence when this strain is inoculated in BALB/c or Swiss mice.<br/>To study the relation between zinc and virulence two mutants were constructed a zur and a znuC mutant. The first one has its zinc-uptake systems deregulated, and we observed that in this case the virulence was lower when this strain was intraperitoneally inoculated in BALB/c mice. But is in the znuC mutant, where the high-affinity zinc uptake system was affected, when it was, either in an oral or an intraperitoneal inoculation, the greatest reduction of virulence capacity.<br/>Finally, the relation of mutation rates and virulence was also tested. To do that, two strains of S. typhimurium presenting increased mutation rates, either spontaneous or mediated by DNA damage have been constructed. One of the strains carries a null mutS mutation, while the other harbours a plasmid which contains the Escherichia coli umuDC operon. The virulence of these strains has been determined by inoculated in BALB/c or Swiss mice. Strains with either increased spontaneous or DNA damage mediated mutation rates have the same LD50 than the wild type strain. Moreover, our work point out that the DNA damage level during mouse infection it is not enough to activate the S. typhimurium SOS response. <br/><br/>The papers that are included in anexos I, II and III contained the main results that are the basis for this work.<br/><br/>Anexo I: Campoy, S., A. M. Pérez de Rozas, J. Barbé e I. Badiola. 2000. Virulence and mutation rates of Salmonella typhimurium strains with increased mutagenic strength in a mouse model. FEMS Microbiol. Lett. 187:145-150<br/><br/>Anexo II: Campoy, S., M. Jara, N. Busquets, A. M. Pérez de Rozas, I. Badiola y J. Barbé. 2002. Intracellular cyclic AMP concentration in decreased in Salmonella typhimurium fur mutants. Microbiology 148:1039-1048<br/><br/>Anexo III: Campoy, S., M. Jara, N. Busquets, A. M. Pérez de Rozas, I. Badiola y J. Barbé. 2002. Role of the high-affinity zinc uptake znuABC system in Salmonella enterica serovar Typhimurium virulence. Infect. Immun. 70:4721-4725.