Caracterización de la reacción citoquímica de Mycobacterium tuberculosis con rojo neutro. Correlación con el contenido de sulfolípido

Abstract

CARACTERIZACIÓN DE LA REACCIÓN CITOQUÍMICA DE Mycobacterium tuberculosis CON ROJO NEUTRO. CORRELACIÓN CON EL CONTENIDO DE SULFOLÍPIDO<br/><br/>La virulencia de M. tuberculosis se ha relacionado con diversas características fenotípicas y entre las menos exploradas se encuentran las reacciones citoquímicas con diferentes colorantes básicos. Los estudios más prometedores en este campo han sido los que describen la tinción de las cepas virulentas de M. tuberculosis con rojo neutro (RN). <br/>El principal objetivo de este trabajo ha sido evaluar el papel desempeñado por los glicolípidos de pared, especialmente sulfolípidos (SL), en la tinción de las cepas virulentas de M. tuberculosis con RN. Además, se planteó conocer la región genómica de la cepa virulenta H37Rv implicada en la fijación de RN (RN+).<br/>Se compararon los perfiles glicolipídicos de la superficie de cepas RN+ y RN- de M. tuberculosis mediante cromatografía en columna de intercambio iónico (DEAE) y de capa fina (CCF). También se purificaron diferentes fracciones glicolípidicas de la superficie y se analizó su capacidad de fijar RN (NRA). No se encontró una relación directa entre el contenido de SL, PL y PIM, y el carácter RN+ de M. tuberculosis. Simultáneamente se buscaron las condiciones óptimas para la tinción de micobacterias con RN en tubo de ensayo, y se desarrolló un método para fijar colonias de micobacteria en placas de agar Middlebrook 7H10-OADC modificado. Una combinación de los dos anteriores permitió desarrollar una técnica para la tinción con RN de colonias de micobacteria en placa de cultivo. Adicionalmente se desarrolló un método para la detección rápida de SL en cepas de M. tuberculosis por medio de cromatografía en capa fina de dos dimensiones (CCF-2D), y otro para diferenciar M. tuberculosis H37Ra, de H37Rv y aislados clínicos mediante tinción citoquímica.<br/>Por otra parte se construyó una genoteca M. tuberculosis H37Rv en el cósmido "shuttle" pYUB18, la que se transformó en la cepa RN- Mycobacterium smegmatis mc2155 y se cribó mediante tinción con RN en placas de cultivo. Se identificaron tres colonias RN+ de M. smegmatis mc2155, a partir de las cuales se dedujo mediante secuencia nucleotídica, complementación de M. smegmatis mc2155 y análisis de restricción, que la región del genoma de M. tuberculosis H37Rv comprendida entre los marcos abiertos de lectura Rv0570 a Rv0577 estarían posiblemente implicados en el carácter RN+ de las cepas de M. smegmatis mc2155 que fijaron RN.

The M. tuberculosis virulence has been correlated with different phenotypic markers, being the cytochemical reactions with basic dyes the less explored. In this field, the most promising studies have been the staining of M. tuberculosis virulent strains with neutral red (RN).<br/>The main objective of this work has been to study the role of cell-surface glycolipids, mainly sulfolipids (SL) in the staining of the virulent strains of M. tuberculosis with NR. Additionally, the genomic region possibly involved in the RN+ phenotype of M. tuberculosis H37Rv was searched.<br/>The glycolipidic cell-surface profiles of M. tuberculosis strains that fix or not RN (RN+, or RN-) were compared through ionic interchange column chromatography (DEAE) and thin layer chromatography (CCF). Also, different cell-surface glycolipidic fractions were purified, and their ability for NR fixation (NRA) was analyzed. No direct correlation between the RN+ phenotype and the SL, phospholipids and phosphatidilinositolmannosides (PIM) content were found.<br/>The best conditions for NR staining of M. tuberculosis cells in screw-cap tubes were optimized. At the same time a method for fixation of mycobacterial colonies in Middlebrook 7H10-OADC modified agar was developed. These results allowed the design a technique for NR staining of colonies growth in agar plates. In addition, a method for rapid detection of SL in M. tuberculosis strains by two-dimensional thin layer chromatography (CCF-2D), and other for the differentiation between M. tuberculosis H37Ra from H37Rv and clinical isolates, were developed.<br/>By the other hand, a library of M. tuberculosis H37Rv was constructed in the "shuttle" cosmid pYUB18 and transformed in the (RN-) Mycobacterium smegmatis mc2155 strain. Three RN+ colonies of M. smegmatis mc2155 (pYUB18::H37Rv) were found by NR staining. Using DNA sequence, complementation of M. smegmatis mc2155, and enzyme restriction analysis, that the M. tuberculosis H37Rv genomic region within the open reading frames Rv0570 to Rv0577 could be possibly involved in the RN+ phenotype of the M. smegmatis mc2155 (pYUB18::H37Rv) that fixed NR.