Epidemiologia de la carbapenemasa OXA-48 en aïllats de Klebsiella pneumoniae a Catalunya

Abstract

La carbapenemasa OXA-48 esta àmpliament estesa arreu del món i principalment en Enterobacteriaceae. A Catalunya, Klebsiella pneumoniae productora de la carbapenemasa OXA-48 es va detectar per primer cop al 2009, i des d’aleshores semblava observar-se un cert increment. L’observació d’aquest increment per part de diferents hospitals fou la raó per a iniciar aquest estudi multicèntric que inclou 11 hospitals comarcals i l’Hospital de la Santa Creu i Sant Pau i que té com a principal objectiu la caracterització, tant a nivell epidemiològic com molecular, de les soques de K. pneumoniae productores d’OXA-48 aïllades al llarg del 2012. En l’estudi es van incloure totes aquelles soques de K. pneumoniae que presentaven un fenotip de resistència als antibiòtics betalactàmics diferent al patró natural esperat. A les soques seleccionades se’ls hi va realitzar el test de Hodge modificat (THM) per poder evidenciar la presència de qualsevol enzim amb activitat enfront els carbapenèmics. D’un total de 3.901 soques de K. pneumoniae aïllades, 171 (4,4%) van ser positives per al THM. Per PCR es van confirmar com a portadores de l’OXA-48 85 soques (49,7%). El vuitanta nou percent de les 85 soques productores de l’OXA-48 coexpressaven la BLEA CTX-M-15, acompanyada o no d’OXA-1 i/o TEM-1. Es va estudiar la clonalitat d’aquestes 85 soques per macrorestricció genòmica (PFGE) i MultiLocus Sequencing Type (MLST). Per PFGE es varen observar cinc clones: A, B, C, D i E; que es van correlacionar perfectament amb les cinc seqüència tipus trobades: ST101, ST17, ST1233, ST14 i ST405. La ST1233 va ser descrita per primer cop en aquest estudi. El gen blaOXA-48 es trobat situat en un plasmidi conjugatiu del grup d’incompatibilitat IncL, (62 Kb aprox) i localitzat majoritàriament en Tn1999.2 (91,7%). Es va descartar que la resta de betalactamases trobades estiguessin en aquest plasmidi. De les 85 soques productores d’OXA-48, 75 (88,23%) tenien el gen qnrB. També es varen estudiar els gens implicats en la resistència enzimàtica als aminoglicòsids. De les 85 soques estudiades, 82 es mostraren resistents a algun dels aminoglicòsid estudiats, El fenotip majoritari, va ser la resistència a kanamicina, tobramicina i gentamicina (KTG) i s’explica per la presència dels gens aac(3’)-IIa (KTGN) i aac(6)-Ib (KTAN). Es van observat que soques genèticament relacionades (igual PFGE, ST i presencia dels mateixos gens de resistència) presentaven nivells de resistència diferents. Aquestes diferencies no es varen poder associar a l’activació de bombes d’expulsió AcrAB ni alteracions de les porines estudiades. Els resultats obtinguts per les tècniques clàssiques (PCR, Seqüenciació, PFGE i MLST) van ser comparats en 37 soques amb la nova tècnica de la seqüenciació massiva del genoma microbià (Whole Genome Sequencing: WGS) i el cgMLST (core genome MultiLocus Sequence Typing). Es resultats mostraren una bona correlació entre PFGE-MLST i cgMLST. A l’introduir les seqüències obtingudes pel WGS als webs PlasmidFinder i al ResFinder, vàrem poder identificar plasmidis recentment tipificats i la presència d’altres gens de resistència, com: strA/strB, oqxA/oqxB ,drfA, sul2, fosA, catB3, tet(A) i tet(D). Amb les seqüències obtingudes per WGS també es va obtenir les seqüències de les dianes d’acció de les quinolones, els QRDR. Nomes es varen detectar alteracions en les tres soques del ST101. En conclusió, l’increment de la prevalença de K. pneumoniae portadora d’OXA-48 a Catalunya es deu a la presència en tots els hospitals on s’han aïllat aquestes soques de l’expansió de les clones ST405 i ST101. No havent-hi trobat diferencies en l’entorn genètic del gen que es el mateix que s’ha anat a descrivint arreu. Per altra banda, podem afirmar que la WGS és una bona eina per a la descripció epidemiològica i molecular de brots produïts per a soques multiresistents.

The OXA-48 carbapenemase is widely spread around the world and found mainly in Enterobacteriaceae. In Catalonia, OXA-48-producing Klebsiella pneumoniae was first detected in 2009, since then, a growing prevalence has been observed in different hospitals, which prompted the aim of this multicenter study, which includes 11 regional hospitals and the Hospital de Santa Creu i Sant Pau, is the characterization, both epidemiological and molecular, of OXA-48–producing K. pneumoniae strains isolated throughout 2012. The study included all K. pneumoniae strains with an unusual pattern of resistance to beta-lactam antibiotics. Selected strains underwent a modified Hodge test (MHT) to detect any enzyme activity against carbapenemics. A total of 3,901 K. pneumoniae strains, 171 MHT-positive strains (4.4%) were selected. PCR confirmed that 85 strains carried OXA-48 (49.7%). Eighty nine percent of the 85 OXA-48–producing strains coexpressed the ESBL CTX-M-15, with or without beta-lactamases OXA-1 and TEM-1. The clonality of these 85 OXA-48–producing strains was studied by macrorestriction analysis (PFGE) and multilocus sequence typing (MLST). Five clones were observed by PFGE: A, B, C, D and E. These five clones were perfectly correlated with the five sequence types found, ST101, ST17I, ST1233, ST14 and ST405. ST1233 is described for the first time in this study. The blaOXA-48 gene was found in a conjugative plasmid of incompatibility group IncL (aprox. 62 Kb) and located in Tn1999.2 (91.7%). The other beta-lactamase genes of these strains were not found in this plasmid. Of the 85 OXA-48–producing strains, 75 (88.23%) harboured the qnrB gene. Genes involved in enzyme-mediated resistance against aminoglycosides were also studied. Of the 85 OXA-48–producing strains, 82 showed resistance to some of the aminoglycosides studied. The major phenotype showed resistance to kanamycin, gentamicin and tobramycin (KTG), and it was explained by the presence of aac(3')-IIa (KTGN) and aac(6’)-Ib (KTAN) genes. We observed that genetically related strains (that is, closely related PFGE, identical ST and the presence of the same resistance genes) showed different levels of resistance. These differences couldn’t be due to alterations in the expression of the efflux pump AcrAB or in porins. Results obtained by classical techniques (PCR, sequencing, PFGE and MLST) in 37 strains selected were compared with those of the new techniques of massive sequencing of microbial genomes (Whole Genome Sequencing: WGS) and cgMLST (core genome MultiLocus Sequence Typing). A good correlation was found between PFGE-MLST and cgMLST, and four strains were identical by cgMLST but not by PFGE. After uploading the sequences obtained by WGS to the PlasmidFinder and ResFinder online search tools, we were able to identify recently classified plasmids and determine the presence of other resistance genes, such as: strA / strB, oqxA / oqxB, drfA, sul2, fosA, catB3, tet(A) and tet(D). The use of WGS allowed us to obtain sequences of the targets of the quinolones, the QRDR. Surprisingly, only alterations described as responsible for this resistance were detected in all three ST101 strains. In conclusion, the increase in the prevalence of OXA-48-carrying K. pneumoniae in Catalonia is due to the expansion of the ST405 and ST101 clones in all hospitals where strains were isolated. No differences in the genetic background of the blaOXA-48 gene were found, as reported elsewhere. Moreover, WGS was found to be a useful tool for the molecular and epidemiological analysis of outbreaks caused by multidrug-resistant strains.