Identificación de un candidato para el gen nsv que confiere resistencia al virus de las manchas necróticas del melón (mnsv) mediante clonaje posicional

Abstract

El melón (Cucumis melo L.) es una hortaliza de gran importancia económica en la que existen numerosos programas de mejora genética. Uno de los objetivos de estos programas ha sido la incorporación de resistencias genéticas frente a patógenos que provocan importantes pérdidas económicas en este cultivo. <br/>El virus de las manchas necróticas del melón (MNSV) es un Carmovirus endémico de la familia de las Cucurbitáceas cultivadas bajo invernadero. La única resistencia descrita hasta el momento frente a MNSV es la conferida por el gen recesivo nsv de melón. Esta resistencia es efectiva frente a la gran mayoría de aislados conocidos del virus. Se conoce poco sobre el mecanismo de resistencia de la interacción MNSV/nsv. Así pues, el estudio de esta resistencia mediante el clonaje del gen nsv nos permitirá comprender la estrategia que utiliza el virus para infectar a la planta y esta información podrá ser utilizada para un mejor control de este virus.<br/>El objetivo principal de este trabajo ha sido el clonaje del gen nsv mediante la estrategia de clonaje posicional. En primer lugar, el gen nsv fue cartografiado en el grupo de ligamiento 11 del mapa genético de melón generado en nuestro laboratorio. A continuación, una población de 69 LDHs fue utilizada para obtener marcadores AFLPs y RADPs ligados al gen nsv mediante la estrategia del "Bulked Segregant Analysis". Dos mapas genéticos de alta resolución fueron construidos en dos poblaciones diferentes, una F2 de 408 individuos y un BC1 de 2727 individuos. Los marcadores flanqueantes y los que cosegregaban con el gen en la primera población de LDHs fueron convertidos en marcadores de PCR para ser usados fácilmente en estas poblaciones de gran tamaño. Además, dos genotecas de BACs de melón, una generada a partir de un genotipo resistente a MNSV y otra a partir de uno susceptible, fueron examinadas con estos marcadores y se obtuvo un mapa físico de la región del gen nsv mediante paseo cromosómico. En la población F2, los marcadores flanqueantes al gen 1L3 y 5B3sp6 se encontraban separados entre sí por 4 recombinantes, mientras que en la población BC1 los marcadores flanqueantes eran 1L3 y 10O16sp6 y 20 el número de recombinantes entre ellos. La relación distancia física/distancia genética en esta región del genoma de melón se estimó en 228 kb/cM, relación óptima para llevar a cabo el clonaje posicional del gen. Finalmente, se ha llegado a identificar el BAC 1-21-10 que contiene físicamente al gen nsv. <br/>La existencia de microsintenia en la región del gen nsv con una región del genoma de Arabidopsis permitió la identificación de un gen candidato para nsv de una manera rápida. Se identificó el factor de iniciación de la traducción 4E (eIF4E) como el candidato para nsv, que había sido previamente identificado como el responsable de la resistencia frente a potyvirus en pimiento, guisante y lechuga. El desarrollo de un marcador de PCR a partir del eIF4E de melón confirmó que éste cosegregaba con el gen nsv en las poblaciones F2 y BC1. A continuación, la secuenciación completa del ADNc de eIF4E reveló que la única diferencia entre las secuencias del alelo resistente y de dos alelos susceptibles residía en un nucleótido, que correspondía con un cambio de aminoácido en la posición 228 de la proteína: una leucina en el genotipo resistente a MNSV y una histidina en los dos genotipos susceptibles. Probablemente, esta mutación en eIF4E es la responsable de la resistencia presente en PI161375.

The melon (Cucumis melo L.) it is a vegetable of great economic importance in which numerous breeding programs exist. One of the objectives of these programs has been the incorporation of genetic resistance forehead to pathogens that cause important economic losses in this culture.<br/>Melon necrotic spot virus (MNSV) is an endemic Carmovirus of the Cucurbit family grown under greenhouse conditions. The melon gene nsv is the only known natural source of resistance against MNSV. This resistance confers protection against all widespread MNSV. Little is known on the resistance mechanism of the MNSV/nsv interaction. Therefore, the study of this resistance by positional cloning of the gene nsv will allow us to understand the strategy that the virus uses to infect to the plant and this information could be used for a better control of this virus.<br/>The main aim of this work has been the cloning of the gene nsv by positional cloning. First, the nsv gene was mapped in the linkage group 11 of the genetic melon map generated in our laboratory. Next, a population of 69 LDHs was used to obtain AFLP and RADP markers around the nsv gene by means of the strategy of the "Bulked Segregant Analysis". Two high-resolution genetic maps were constructed in two different populations, a F2 of 408 individuals and a BC1 of 2727 individuals. The flanking markers and those that they co-segregated with the gene in the first population of LDHs were converted into PCR markers to be used easily in these populations of great size.In addition, two melon BACs libraries, one generated from a resistant genotype to MNSV and another one from one susceptible one, were examined with these markers and a physical map of the nsv region was obtaining by chromosomal walking. In the population F2, nsv-flanking markers 1L3 and 5B3sp6 were separated to each other by 4 recombinant, whereas in population BC1 the flanking markers were 1L3 and 10O16sp6 and 20 the number of recombinant among them. In this melon genome region the physical/genetic relationship was considered in 228 kb/cM, optimal relation to carry out the positional cloning of the nsv gene. Finally, we also identified a single BAC 1-21-10 that physically contains the gene nsv.<br/>The existence of microsintenia between the nsv region and a region of the Arabidopsis genome allowed to the identification of a gene candidate for nsv in a fast way. The eukariotic Initiation Factor 4E (eIF4E) was identified like a candidate for nsv. eIF4E had been previously identified as the gene that confers resistance against potyvirus in pepper, pea and lettuce. The development of a PCR marker from eIF4E of melon confirmed that this one co-secreted with the nsv in the F2 and BC1 populations. Next, sequencing full-length cDNA of eIF4E revealed only one difference between a resistant genotype and two susceptible genotypes. This mutation corresponds with a change of amino acid in the protein position 228: a leucine in the resistant genotype to MNSV and a histidine in both susceptible genotypes. Probably, this mutation in eIF4E is the responsible for the resistance in PI161375.