Origen, evolució i aplicacions en genètica de la conservació de DNA repetitiu en carnívors

Abstract

L'objectiu global de la meva tesi doctoral és l'estudi de la variació genètica en el DNA repetitiu en carnívors per resoldre qüestions evolutives d'aquestes espècies i per les seves possibles aplicacions en genètica de la conservació. La tesi es divideix en quatre capítols:<br/>El primer capítol és un article, en revisió per la revista Journal of Heredity. En aquest treball hem seqüenciat de 4 a 10 al·lels de 10 microsatèl·lits de teixó eurasiàtic en el teixó i en altres espècies de mustèlids per tal de detectar aquells arrays repetitus que seguirien les assumpcions del SMM i determinar i indagar l'origen de la variabilitat que no pot ser detectada per procediments estàndards de genotipatge. <br/>El segon capítol és un article publicat a Genetical Research. En aquest treball hem aprofitat la conservació en carnívors de la regió flanquejant d'un microsatèl·lit compost complex per analitzar el seu origen i diversificació per tal d'avançar en els coneixements dels processos mutacionals que porten a l'origen de regions repetitives curtes i adjacents. També hem comprovat que a pesar de la complexitat mutacional d'aquest locus i els alts nivells d'homoplàsia observats, es pot detectar informació filogenètica, tant en la regió flanquejant com en la repetitiva. Com a part d'aquesta anàlisi, hem construït un arbre filogenètic basat en les regions flanquejants i hem comparat els nostres resultants amb les controvèrsies actuals en filogènies de carnívors.<br/>El tercer capítol és un article publicat a la revista BMC Genomics. En aquest treball hem construït una base de dades completa de clons de microsatèl·lits de carnívors a partir de GenBank per explorar el paper que poden tenir els elements repetitius dispersos en la generació de arrays repetitius. Per dur a terme el treball, ens hem centrat en els tRNA SINEs, que són els elements repetitius dispersos més abundants i més ben caracteritzats del genoma dels carnívors. Hem observat dos modes de gènesi de microsatèl·lits en dues regions dels tRNA SINEs en les quals els microsatèl·lits han evolucionat repetidament. Aquestes observacions porten a la hipòtesi que els SINEs que generen microsatèl·lits podrien explicar el diferent contingut i distribució d'arrays de repetició entre i dins dels genomes. També hem demostrat que els microsatèl·lits associats a tRNA SINEs eren més complexes i tenien menys potencial d'inestabilitat que aquells no associats. Per tant, les observacions mostrades en aquest treball tenen implicacions pràctiques, ja que l'ús de microsatèl·lits associats amb tRNA SINEs comporta prendre mesures des del disseny experimental fins a la interpretació dels resultats.<br/>El darrer capítol és un article publicat a la revista Journal of Zoology. En aquest treball hem proporcionat un mètode molecular fiable, simple i barat basat en l'amplificació del locus microsatèl·lit Mel08 per poder diferenciar les espècies de visons. Aquesta amplificació dóna com a resultat un producte de PCR major en el visó americà que en altres espècies de mustèlids, tals com el visó europeu o el turó. Aquestes 3 espècies mostren prioritats de gestió molt diferents i són difícilment distingibles sense capturar l'animal. Sobre el visó europeu s'estan realitzant programes de conservació intensius mentre que el visó americà és una espècie exòtica a Europa i és una possible causa del declivi del visó europeu. A més a més, el mètode va ser testat amb èxit amb DNA amplificat amb pèl amb arrel, de manera que el mètode és apte per ser utilitzat amb mostreig no invasiu.

The main goal of this Ph.D. thesis is the study of genetic variation in the repetitive DNA of carnivores to answer evolutive questions of these species and for their possible application in conservation genetic field. This work is divided in 4 chapters:<br/>The first chapter is an article under revision by Journal of Heredity. In this study<br/>we sequenced four to ten alleles from each of ten Eurasian badger microsatellites in badgers and other mustelids in order to detect microsatellites that follow SMM and to determine and inquire into the origin of variability that cannot be detected through standard genotyping procedures.<br/>The second chapter is an article published in Genetical Research. In this work we took advantage of the fact that among carnivores the regions flanking a complex repetitive locus are conserved to analyse their origin and diversification in order to advance in the understanding of the mutational processes leading to the origin of short and adjacent repetitive regions. We also checked whether, despite the mutational complexity of this locus and the high levels of homoplasy observed, phylogenetic information can still be detected in both the repeat and flanking regions. As a part of this, we constructed a phylogenetic tree based on these flanking regions and compare our results with other data from the literature that relate to relevant controversies in carnivore phylogeny. <br/>The third chapter is an article published in BMC Genomics. In this study we constructed a comprehensive database of carnivore MS clones from GenBank to explore the role of interspersed repeats in the generation of repeat arrays. We focused on tRNA SINEs which constitute the best characterized and most abundant interspersed repeat element in the carnivore genome. We observed two modes of MS genesis in two regions of tRNA SINEs in which MSs have repeatedly evolved. This observation led us to hypothesize that SINEs generating MSs could explain part of the different repeat array content and distribution among and within genomes. We also demonstrated that MSs associated with tRNA SINEs were more complex and had less potential instability than those not associated. These observations have practical implications since the use of MSs related with tRNA SINEs calls for special attention from the designing of experiments to the interpretation of results. <br/>The last chapter is an article published in Journal of Zoology. In this work, a simple, cheap and reliable molecular method for the genetic distinction of mink was provided based on the amplification of the microsatellite locus Mel08 that results in a longer PCR product in American mink than in other mustelid species, such as the European mink and the European polecat. These 3 species show different manegement priorities and are difficult to differentiate without capturing the animal. The European mink is the focus of extensive conservation programmes whereas the American mink is exotic in Europe and a possible cause of European mink decline. The method was successfully tested with DNA amplified from a large sample of hair roots, thus making it suitable for non-invasive sampling.