Variación epigenética y expresión del par de genes w y CG32795 en distintas cepas mutantes zeste(1) de Drosophila melanogaster

Abstract

El presente trabajo de tesis estudia diferentes mutantes zeste1 y el efecto que esta mutación tiene sobre la regulación de la transcripción en diversos genes. <br/>En primer lugar se estudiaron los machos de las cepas M115 y RM115 cuya característica principal, además de ser portadores de la mutación z1, es la inserción de un elemento FB-NOF en el tercer intrón del gen CG32795, que forma con white un par de genes head-to-tail. Para estudiar el efecto de la inserción de FB-NOF en un entorno z1, fue necesario en primer lugar caracterizar el gen CG32795, a nivel de secuencia del mRNA y de predicción de la posible función de la proteína codificada. Se encontraron diversas variantes de splicing, tanto para su extremo 5' como para el 3', parecidas pero diferentes de las variantes predichas anteriormente. Conociendo más en profundidad este gen, nos propusimos estudiar los posibles efectos de la inserción de FB-NOF respecto a la expresión de los genes w y CG32795. Los resultados nos llevaron a un estudio más detallado de la expresión de w en diferentes partes del cuerpo, teniendo en cuenta la especificidad de tejido que la interacción zeste-white presenta. Así, demostramos que el gen w no se ve afectado por la inserción de FB-NOF en su extremo 3' y que las diferencias de expresión observadas son debidas a la duplicación del Zeste Binding Site de w en un entorno z1. Sin embargo, la inserción de FB-NOF en el tercer intrón de CG32795 si modifica la expresión de este gen. La inserción no es sólo responsable de la alteración de la expresión de CG32795 sino también la reordenación que se produce en la cepa RM115 eliminando la copia de w original y dejando la que se duplicó en M115.<br/>La segunda parte de esta tesis estudia las hembras mutantes z1. Analizamos la expresión de dos genes con un ZBS (w y dpp) y observamos como se reduce la expresión de dichos genes en las hembras z1. Además, estudiando la expresión del gen CG32795 constatamos que el efecto de la interacción zeste-white es local, sin afectar a CG32795 aunque su extremo 5' se encuentra a tan solo 700bp del extremo 3' del gen w. La reducción de la expresión podría ser debida a alteraciones en la estructura de la cromatina, puesto que los agregados de Zeste en los ZBS son los responsables de reclutar el complejo remodelador de la cromatina BRM, facilitando así la transcripción. Mediante un ensayo de nucleasa micrococal detectamos algunas modificaciones en el posicionamiento de nucleosomas en los ZBS de w y dpp, siendo el posicionamiento en las hembras z1 más estricto. Si el complejo BRM es el responsable de estas diferencias, los patrones de metilación también podrían verse alterados, pues muchos factores asociados a los complejos SWI/SNF se han relacionado con actividades de regulación de la expresión mediante modificación de los mismos. Mediante el ensayo de modificación del DNA por bisulfito sódico estudiamos los patrones de metilación de cinco regiones. Sorprendentemente, el ZBS de w y de dpp, así como las regiones próximas a ellos, se encontraban hipometilados en las hembras z1. El desconocimiento general sobre la metilación en D. melanogaster nos hizo plantear cuales pueden ser las secuencias diana de la metilación en esta especie. Así realizamos un estudio estadístico sobre cuales son las dos bases anteriores y posteriores a las Cs metiladas en nuestras secuencias. Se obtuvieron diferencias en las frecuencias de cada posición y se estableció como secuencia más frecuente para ser metilada ApDp5mCpDpD. Aún así, es una secuencia muy degenerada, y se hacen necesarios estudios más profundos y amplios para confirmarla.

The present PhD thesis studies several zeste1 mutants and this mutation effect over the transcriptional regulation of some genes. <br/>The first part is based on the study of the males of M115 and RM115 strains, mainly characterized by the z1 mutation and the insertion of a FB-NOF element in the third intron of the CG32795 gene, known to form a head-to-tail gene pair with white. To study the FB-NOF insertion effect on a z1 background firstly we need to characterize the CG32795, its mRNA sequence and the codified protein predicted structure and function. Several splicing variants were found, not only for its 5' end but also for its 3'end, similar but different from the ones been predicted previously. Once obtained this information we proceeded to study the effects of the FB-NOF insertion over the w and the CG32795 gene expression. The results lead us to a deeper study of the w expression in different body segments, taking into account the zeste-white interaction tissue specificity. Thus, we proved that the w gene expression is not affected by the FB-NOF insertion downstream of its 3' end. The differences observed in the w expression levels were due to the duplication of the w Zeste Binding Site in a z1 background. On the contrary, the FB-NOF insertion not only does modify CG32795 expression, but also mediates the reordenation produced in the RM115 strain being responsible of the w original copy lost and leaving alone the w copy duplicated in the M115 strain.<br/>The second part studies the z1 female mutants. We analyzed the expression of two genes possessing a ZBS (w and dpp). The results obtained showed an expression reduction for both genes in the z1 females. Moreover, through the study of the CG32795 gene expression we showed that the zeste-white interaction effect is local, not having any effect on CG32795 expression even though its 5' end is located at only 700bp from the w gene 3' end. Knowing that the Zeste aggregates in the ZBS recruit the chromatin remodelling complex BRM, facilitating thus transcription, we thought that the expression reduction might occur due to chromatin structure alterations. A micrococal nuclease assay was performed and some modifications in nucleosome positioning were found in w and dpp ZBS, being the positioning in the z1 females stricter. Were the BRM complex responsible of those differences, the DNA methylation patterns might also be changed, since many SWI/SNF associated factors have been related to expression regulation duties through DNA methylation patterns modification. A bisulphite modification assay was performed, studying the DNA methylation pattern of five different regions. Surprisingly, w and dpp ZBS and the regions surrounding them were hypomethylated in the z1 females. The little information available about DNA methylation in D. melanogaster encouraged us to study the DNA methylation sites in this specie. Our sequences were statistically analyzed including the two bases before and after the methylated cytosine. The results showed differences in the each nucleotide frequency in each position. The preferently methylated "consensus sequence": ApDp5mCpDpD. However, it is a much degenerated sequence and deeper and broader studies are required to confirm it.