Production of protein nanomaterials in lactic acid bacteria for human and animal medicine

Abstract

Tot i que Escherichia coli és el bacteri més àmpliament usat en el camp de la producció de proteïnes recombinants, aquest conté lipopolisacàrids (LPS) en la seva membrana externa. Com a conseqüència de la presència d’aquest contaminant bacterià, el potencial dels productes proteics produïts amb finalitats mèdiques en aquest microorganisme Gram-negatiu es veu severament limitat. En aquest context, els bacteris de l’àcid làctic (BAL), un grup de microorganismes Gram-positius, han anat guanyant importància com a alternativa per la producció de proteïnes recombinants segures. Els BAL, que no contenen endotoxines, són àmpliament reconeguts pel seu ús en la indústria alimentària, i a més a més, han estat classificats com organismes “Generally Recognized As Safe” (GRAS) per part de les agències reguladores. Tanmateix, durant les últimes dècades, diverses eines han estat desenvolupades per millor els sistemes d’expressió proteics GRAS, amb l’objectiu de sintetitzar proteïnes heteròlogues lliures de toxines , la majoria d’aquetes utilitzant el bacteri Lactococcus lactis. Les proteïnes recombinants solubles s’associen normalment a una elevada inestabilitat i a alts costos associats als processos de producció i purificació, esdevenint econòmicament inviables pel desenvolupament de productes comercials basats en proteïnes per medicina humana i, molt especialment, per medicina animal. Contràriament, l’ús de proteïnes heteròlogues en forma de nanopartícules amiloides biològicament actives, s’ha presentat com una alternativa rentable i estable. Estudis recents evidencien l’enorme potencial d’aquestes nanopartícules proteiques en l’àmbit de la nanomedicina. No obstant, tot i el seu potencial, aquestes nanopartícules han estat bàsicament produïdes en E.coli i, fins al moment, la seva producció no ha estat explorada en BAL. A més a més, la seva ultraestructura no s’ha estudiat en detall, essent una important tasca que encara queda per resoldre. Així doncs, en aquest estudi, hem descrit l’organització supramolecular d’aquestes nanopartícules composades alhora per proteïnes en estat amiloide i natiu. D’altra banda, hem dut a terme el desenvolupament d’una metodologia per tal de produir materials proteics econòmics, segurs i funcionals mitjançant una plataforma de producció lliure de LPS. Concretament, s’ha utilitzat L. Lactis per tal de produir aquestes nanoestructures proteiques recombinants amb rellevància en medicina humana i animal. Així mateix, s’han determinat també les propietats fisicoquímiques d’aquestes nanopartícules fent ús d’una amplia varietat de tècniques. A grans trets, degut a característiques com la seva activitat biològica, estabilitat, versatilitat i seguretat, aquestes nanopartícules proteiques esdevenen un material prometedor per finalitats terapèutiques.

Despite Escherichia coli is the workhouse for recombinant protein production purposes, this bacterial species contains lipopolysaccharide (LPS) in its outer membrane. Consequently, the presence of bacterial endotoxic contaminants severely restricts the potential medical applications of protein goods produced in this Gram-negative microorganism. In this context, lactic acid bacteria (LAB), a group of Gram-positive microorganisms, has been gaining momentum as an alternative for the production of safe recombinant proteins. LAB, which lack endotoxins, are widely well-known by their use in the food industry and are generally recognized as safe (GRAS) organisms by regulatory agencies. Interestingly, during the last decades, many tools have been developed using these food-grade expression systems with the aim to synthesise heterologous proteins, most of them being developed in Lactococcus lactis. Recombinant soluble proteins are often associated to instability and high production and purification costs, being not economically viable for the development of protein-based commercial products for human, but specially, for animal medicine. In this regard, the use of heterologous proteins in form of biologically active amyloidal nanoparticles has been shown to be a cost-effective and stable alternative. Concomitantly, recent studies evidence the enormous potential of these protein-based nanoparticles in nanomedicine. Nevertheless, despite its potential, protein nanoparticles have essentially been produced in E. coli and they have never been described as LAB products. Besides, their ultrastructure has not been studied in detail, remaining as an unsolved task. Thus, in the present study, we have further described the supramolecular organization of these protein nanoparticles composed by both amyloid-like and native-like proteins. On the other side, we have developed a methodology to produce inexpensive, safe, and functional protein-based materials in a LPS-free production platform. Specially, we have used L. lactis to produce nanostructured recombinant proteins relevant for human and animal medicine. Besides, we have also determined the physico-chemical properties of such nanoparticles using a wide variety of techniques. Altogether, the biological functionality, stability, safety, and te versatility of the platform, make these protein-only nanoparticles a very promising material for therapeutic purposes.