Dispositius impedimètrics per a la detecció directa de microorganismes

Abstract

La detecció de bacteris patògens en medis aquosos és d’alta importància en diversos camps. Un diagnòstic ràpid de la qualitat de les aigües és fonamental per evitar exposar la població a patògens. Els mètodes de detecció tradicionals requereixen períodes d’incubació d’entre 18 a 96 hores i, per tant, fins que no se sàpiguen els resultats hi ha risc d’infecció. Els biosensors es caracteritzen per ser senzills d’utilitzar i per no requerir grans equips per realitzar-ne les mesures. A més, són fàcils d’integrar a sistemes de flux i els resultats es poden obtenir de manera instantània i serien idonis per assolir unes mesures a temps real. Per aquest motiu, en aquest treball es planteja l'ús de biosensors elèctrics basats en impedància no faradaica per assolir l’objectiu de detectar bacteris en medis aquosos. Aquest tipus de biosensors permeten la detecció directa sense la necessitat d’afegir cap reactiu addicional i la distinció entre bacteris vius i morts. Aquest treball de tesi parteix d'un treball previ en el què es proposava la detecció de bacteris mitjançant mesures de la capacitat de la solució (Cs) i s'atribuïa la diferenciació entre cèl·lules vives i mortes a la diferència de volums i propietats elèctriques dels diferents tipus de cèl·lula. En aquesta tesi es fa un replantejament d'aquests estudis i es proposa que la distinció entre cèl·lules vives i mortes recau en la diferència de la conductivitat del seu medi intern i que, com a conseqüència de la seva estructura, les cèl·lules vives poden actuar com a partícules conductores o aïllants en funció de la freqüència en què es mesurin. Partint d'aquestes hipòtesis es plantegen diferents objectius que comprenen des d'estudis mitjançant simulacions per elements finits (FEA), a mesures experimentals amb IDEs de diferents geometries, fins l'obtenció d'un nou dispositiu amb un sistema microfluídic integrat per automatitzar les mesures. Mitjançant estudis de simulacions FEA s'avalua l'afectació que suposa el posicionament del bacteri i la conductivitat del medi de mesura. També s'estudia la relació òptima entre la mida del bacteri i la dels elèctrodes interdigitats. Es realitzen mesures per la detecció d'E coli sobre IDEs de 1.5x1.5 µm i de S. cerevisiae sobre IDEs de 6x6 µm. En les mesures d'E. coli s'observa que aquestes responen seguint un patró espectral d'impedància que és únic i es diferencia de la resposta obtinguda per les mesures d'altres esdeveniments que també alteren la impedància. En canvi, pel cas dels llevats, s'observa que actuen com a partícules purament conductores i s'obté una relació lineal entre la cobertura de l'IDE per llevats i el senyal negatiu de Z. Finalment es realitza el disseny i fabricació d'una nova geometria d'IDE per detectar microorganismes sub-micromètrics. Per aquest nou xip es dissenya un encapsulat amb un sistema microfluídic integrat i un imant amb diferents posicions per facilitat la captació immunomagnètica de la mostra. S'optimitzen tots els paràmetres per realitzar les mesures mitjançant la utilització de tècniques com la microscòpia confocal i, finalment, es realitzen mesures directes i indirectes del bacteri i s'analitza la raó dels diferents resultats obtinguts amb les mesures.

Bacterial pathogens are important targets for detection and identification in medicine, food safety, public health, and security. A rapid diagnostic of water quality is fundamental to avoid population exposure to pathogens. Traditional bacterial detection methods need large incubation times (between 18 and 96 hours) during which time people are at risk. Biosensors are easy to use and no complex equipment are needed to use them. Moreover, they are easy to integrate with fluidic systems and the results can be achieved instantaneously. For this reason, this thesis considers the use of electrical biosensors based on non-faradaic impedance to achieve the objective of detecting bacteria in aqueous media. Such biosensors allow direct detection without adding any additional reagent and they permit the distinction between live and dead bacteria. This work is based on a previous work in which was proposed the detection of bacteria by measurements of the capacity of the solution (Cs). The differentiation between dead and living cells was attributed to the difference of volumes and electric properties of each type of cell. This thesis is a rethinking of these studies and it is proposed that in the difference in the conductivity of its internal medium lies the distinction between dead and living cells. Indeed, as a result of its structure, living cells can act as conductive or insulating particles depending on the measured frequency. Based on these assumptions the following studies are performed. Using FEA simulations, we can evaluate the effect of bacteria positioning and the conductivity of measurement medium. The optimum relation between bacteria and interdigitated electrodes size is studied as well. Moreover, measures to detect E. coli with 1.5x1.5 µm IDEs and S. cerevisiae with IDEs de 6x6 µm are performed. A differential impedance spectrum representation is used to study the unique fingerprint that arises when microorganisms attach to the surface of IDEs. For E. coli, that fingerprint shows the dual electrical behavior, insulating and conductive, at different frequency ranges. However, in the case of yeast, it is observed that it acts as purely conductive particle. The design and manufacture of a new geometry of IDE to detect sub-micrometer microorganisms is performed. This new chip is designed with a microfluidic channel and a magnet integrated in the encapsulation to perform immunomagnetic catchment. All settings are optimized using techniques such as confocal microscopy and, finally, direct and indirect measurements of bacteria are carried out and the reason for the different results obtained are analyzed.