Functional and structural studies of AKR1B15 and AKR1B16: Two novel additions to human and mouse aldo-keto reductase superfamily

Abstract

La superfamília de les aldo-ceto reductases (AKR) comprèn un gran nombre de proteïnes monomèriques de localització citosòlica d’un un pes molecular d'aproximadament 36 kDa. Les AKRs tenen un plegament proteic comú evolutivament conservat, que consisteix en un barril (α/β)8. La majoria d’AKRs actuen reduint aldehids i cetones als seus respectius alcohols en una reacció dependent de NADPH, amb un ampli espectre de substrats que va des de sucres simples fins a aldehids potencialment tòxics. Aquesta Tesi s’emmarca dins l’estudi estructural i funcional de les AKR realitzat pel nostre grup, especialment la seva contribució dins la via de biosíntesi de l’àcid retinoic (RA). El nostre grup va descriure activitat retinaldehid reductasa en la família AKR i des de llavors ha estat involucrat en l’estudi funcional i estructural de les AKR humanes en relació amb aquest important paper fisiològic. El grup va obtenir l’estructura cristal·logràfica d’AKR1B10, un enzim sobre-expressat en càncer. Es va proposar una relació entre l’alta activitat retinaldehid reductasa de l’enzim i el desenvolupament del càncer. La primera part d’aquesta Tesi està basada en la purificació i caracterització d’un nou enzim AKR humà; AKR1B15, amb un 92% d’identitat seqüencial amb AKR1B10. La proteïna recombinant precipitava en cossos d’inclusió al purificar-se, mostrant activitat limitada quan era solubilitzada amb detergents. Gran part del material solubilitzat estava en forma d’agregats d’alt pes molecular sense activitat. Vam desenvolupar una aproximació nova en AKRs, utilitzant un sistema de coexpressió amb xaperones, incrementant així la forma soluble i monomèrica de la proteïna. L’activitat enzimàtica va ser caracteritzada amb un ampli rang de substrats típics d’AKR. AKR1B15 mostra valors de Kcat i de Km més baixos que AKR1B10, excepte per cetones i α-dicarbonils. Encara més, mostra una eficiència catalítica superior envers el 9-cis-retinaldehid que no pas AKR1B10, trobant-se entre les 9-cis-retinaldehid reductases més eficients de les AKR. Estudis d’inhibició han mostrat que l’enzim té una selectivitat pels inhibidors més restrictiva que no AKR1B10 o AKR1B1, i diversos inhibidors coneguts d’aldosa reductasa (ARI) no l’inhibeixen. Es va construir un model estructural per analitzar les diferències en el lloc d’unió a substrat d’AKR1B15. Els canvis de residus localitzats en els llaços A i C donen lloc a centre actiu més petit, hidrofòbic i rígid d’AKR1B15 comparat amb AKR1B10, cosa que explica la diferent especificitat de substrat i diferent selectivitat d’inhibidors. Es va fer un estudi cel·lular de l’activitat retinaldehid reductasa per transfecció transitòria d’AKR1B15 i AKR1B10 utilitzant cèl·lules HEK293T com a model. Es va observar que AKR1B10, però no AKR1B15, participava en la reducció del retinaldehid i provocava canvis en els nivells cel·lulars d’àcid retinoic. La segona part d’aquesta Tesi s’ha centrat en les diferències estructurals de les butxaques d’unió d’AKR1B15 i AKR1B10 i la diferent funció dels dos enzims. Mutants d’AKR1B10 van ser preparats intentant mimetitzar la butxaca catalítica d’AKR1B15, amb l’objectiu de convertir aquest enzim en l’altre, i comprendre quins són els factors que determinen la diferent selectivitat dels dos enzims. Els mutants van mostrar valors de kcat i de Km més elevats que els enzims salvatges, amb característiques que els assemblaven a AKR1B15, com l’activitat front cetones i la seva habilitat per reduir eficientment el 9-cis-retinal. Finalment, es va realitzar la caracterització d’un nou enzim de ratolí, AKR1B16. Estudis previs havien determinat que AKR1B16 era una proteïna activa expressada en teixits. En aquesta Tesis s’ha realitzar una anàlisi filogenètica, una caracterització cinètica i s’ha determinat la seva activitat amb retinoides. L’enzim va mostrat activitat moderada amb tots els substrats analitzats, amb activitat baixa front retinaldehid. Els resultats porten a la conclusió que AKR1B16 no és una proteïna ortòloga d’AKR1B10 o cap altra AKR1B humana.

The aldo-keto reductase (AKR) superfamily comprises a large number of monomeric proteins with cytosolic localization and a molecular weight of about 36 kDa. AKRs have a common evolutionarily conserved protein fold which consists of a (α/β)8 barrel. Most AKRs act by reducing aldehydes and ketones to their respective alcohols in a NADPH-dependent reaction. This Thesis dissertation is a part of the structural and functional studies performed by our group on the characterization of AKRs, especially on their contribution in the biosynthesis pathway of retinoic acid (RA). Our group identified retinaldehyde reductase activity in the AKR family, and since then has been involved in the deep functional and structural study of the human AKRs in relation to this important physiological role. We obtained the crystallographic structure of the highly efficient retinaldehyde reductase AKR1B10, a human enzyme overexpressed in cancer. A relationship was proposed between high retinaldehyde reductase activity and cancer development. The first part of the Thesis is based on the puri_cation and characterization of a novel human AKR enzyme, AKR1B15, an enzyme sharing 92% sequence identity with AKR1B10. The recombinant protein was expressed mostly in the insoluble fraction, showing limited activity when it was solubilized with detergents. We developed a novel approach in AKRs, using a coexpressing system with chaperones that was successful in increasing the amount of protein in the soluble fraction, in monomeric active form. Enzymatic activity was characterized with a broad range of typical AKR substrates. AKR1B15 shows lower kcat and Km values than those of AKR1B10 with most substrates, with the exception of ketones and α-carbonyls substrates, which resulted in higher catalytic efficiency. Moreover, AKR1B15 showed superior catalytic efficiency towards the 9-cis-retinaldehyde than AKR1B10, being one of the best 9-cis-retinaldehyde reductases within the AKR superfamily. Inhibition studies showed that AKR1B15 has narrower inhibitor selectivity than AKR1B10 and 1B1, and several known aldose reductase inhibitors (ARI) do not inhibit this new enzyme. A structural model was built to analyze the distinct substrate-binding site features of AKR1B15. The residue changes localized in loops A and C, resulting in a smaller, more hydrophobic and more rigid active site in AKR1B15 as compared to the AKR1B10 pocket, which explains the distinct substrate specificity and narrower inhibitor selectivity of AKR1B15. In addition, a cellular study on the retinaldehyde reductase activity of the AKR1B15 and 1B10 enzymes was carried out. Using HEK293T cells as a model and transient transfection, it was observed that AKR1B10, but not AKR1B15, participates in the reduction of retinaldehyde, which results in changes in the amount of RA in the cells. The second part of this work is centered on the study of the relationship between the structural differences of the binding pockets of AKR1B15 and 1B10 and the distinct function of the two enzymes. Mutants of AKR1B10 were prepared to mimic the catalytic pocket of AKR1B15, with the aim of converting one enzyme into the other, and trying to understand the factors that determine their distinct substrate specificity and inhibitor selectivity. The mutant proteins displayed higher kcat and Km values than the wild-type enzymes, with features resembling AKR1B15, such as the activity with ketones, and the ability to efficiently reduce the 9-cis-retinaldehdye isomer. Finally, the characterization of AKR1B16, a novel mouse enzyme, was performed. Previous studies determined that AKR1B16 was an active protein expressed in murine tissues. In this Thesis, we have performed a phylogenetic analysis, and a wide kinetic characterization with a variety of substrates, including retinaldehyde isomers. The enzyme displayed moderate activity with all the assayed substrates being poorly active with retinaldehyde. These results indicate that AKR1B16 is not an orthologous protein of AKR1B10.