Perfil genético funcional en la enfermedad de Crohn complicada. Influencia sobre el desarrollo de recurrencia post-quirúrgica precoz

Abstract

INTRODUCCIÓN: La resección intestinal en la enfermedad de Crohn (EC) no es un procedimiento curativo ya que la enfermedad suele reaparecer en el sitio de la anastomosis, lo que se conoce como recurrencia post-quirúrgica (RPQ). Desde un punto de vista patogénico, la RPQ representa la oportunidad de asistir al proceso que conduce a la manifestación fenotípica de la EC de novo, y por tanto un escenario que permite estudiar distintos factores involucrados en la patogenia. OBJETIVOS: Estudiar los perfiles de expresión ileal de un grupo de pacientes con EC. Identificar los mecanismos genéticos y transcripcionales asociados a la aparición de la RPQ en la EC. Estudiar el reflejo de estos mecanismos diferenciales en la actividad biológica de la mucosa intestinal. MATERIALES Y MÉTODOS: Se incluyeron pacientes con EC que requirieron una resección ileocecal como parte del tratamiento. Los resultados fueron comparados con un grupo de controles (que requirieron resección ileocecal por otro motivo, sin EC). Se obtuvieron tanto muestras de piezas de resección ileocecal como biopsias de seguimiento endoscópico, además de sangre total. Con esas muestras se llevó a cabo estudio histológico convencional, estudio de polimorfismos basado en genes asociados a la EC, estudio del transcriptoma, bioanálisis, así como experimentos para corroborar los hallazgos del microarray de expresión mediante RT-qPCR y caracterización de marcadores mediante el microarray de proteínas, immunoblotting y estudios de inmunohistoquímica e inmunofluorescencia. RESULTADOS: Se incluyeron 20 pacientes con EC y 10 controles (5 pacientes fueron excluidos por presentar un perfil de expresión completamente diferente al resto de sujetos). Finalmente se analizaron 15 pacientes y 10 controles. De ellos 5 presentaron RPQ precoz. El estudio genómico reveló que la recurrencia se asocia a alteraciones en funciones biológicas relacionadas con la autofagia (IRF1, IRGM) y la apoptosis (TNFSFR6/RTEL1, TNFS11). El estudio transcriptómico mostró que la EC presenta descenso de funciones de desintoxicación celular, de fortalecimiento de las uniones para-celulares, del metabolismo energético y de funciones reguladoras de la inmunidad innata; contrariamente, aparece también una respuesta inflamatoria excesiva junto con una elevada actividad reparativa a nivel de la matriz extracelular. Este estudio detectó que de todos los genes evaluados mediante microarrays, TMIGD1 era el que presentaba un mayor bloqueo en los pacientes con EC. Sin embargo, a pesar de que el transcriptoma ileal no mostró cambios de expresión de TMIGD1 en los pacientes con RPQ, estos presentaron un nivel proteico inferior que el de los pacientes sin RPQ. En el íleon la isoforma predominante de TMIGD1 es de 24 kDa, no está glicosilada y se dispone en los microvilli de las células epiteliales diferenciadas. Por otra parte la RPQ mostró perfiles de expresión disminuidos, entre los que destaca la vía de señalización Notch. En relación a esta vía, varías de las proteínas relacionadas (S100A8, CYCLIN D1, NOTCH2, CEACAM, HNFAG) presentaron una expresión aumentada en los pacientes que desarrollaron RPQ, a excepción del TGFβ1, que estuvo disminuida, lo que podría corresponder a una menor modulación en la diferenciación celular en el epitelio intestinal. De hecho, la caracterización de los linajes de células epiteliales no mostró cambios significativos en ninguna estirpe, a excepción de las células caliciformes, que se encontraron considerablemente aumentadas en las criptas ileales de los pacientes que evolutivamente presentaron RPQ. CONCLUSIONES: Esta es la primera ocasión que se estudia el TMIGD1 en la EC, relacionándose con la diferenciación y recuperación de la homeostasis del epitelio intestinal. La RPQ parece suponer la pérdida del equilibrio homeostático entre proliferación y diferenciación, existiendo una inhibición de la vía del Notch. El aumento de células caliciformes en el tejido ileal podría predecir la RPQ precoz.

BACKGROUND: Intestinal resection for Crohn's disease (CD) treatment is not curative since the disease often recurs at the site of the anastomosis, a phenomenon known as post-surgical recurrence (PSR). From a pathogenic point of view, PSR represents an opportunity to attend to all the process leading to the phenotypic expression of de novo CD, as it is a scenario that allows the study of different factors and their interactions in individuals with known CD but before and during the development of histological lesions. AIMS: To study the intestinal expression profiles in a group of CD patients, to identify genetic and transcriptional factors associated with the development of CD PSR, and to study the genetic influence of different mechanisms on the biological activity of terminal ileum transcriptome. METHODS: CD patients requiring ileocecal resection were included. The results were compared with a control group (ileocecal resection as a treatment of other conditions, but not CD). Samples of both ileocecal resection and endoscopic follow-up biopsies were processed, as well as total blood samples. The methods used in this study included conventional histology, polymorphisms of genes associated with CD, transcriptomic study, bioanalysis, and corroborative experiments: RT-qPCR and marker characterization by protein microarray, immunoblotting, immunohistochemistry, and immunofluorescence studies. RESULTS: Twenty patients with CD and 10 controls were included (5 patients were excluded for presenting a completely different expression profile compare to the rest of the included subjects, both controls and the other patients). Finally 15 patients and 10 controls were analysed. Of these 5 had early PSR. The transcriptomic study revealed that CD showed a decrease in cellular detoxification function, in tight junction maintenance, in energetic metabolism, and in innate immunity regulatory function, while presenting an excessive inflammatory response, and a high reparative activity of the extracellular matrix. Genomic study revealed that PSR was associated with autophagy (IRF1, IRGM) and apoptosis (TNFSFR6 / RTEL1, TNFS11) impairment. PSR transcriptomic study showed changes in cell cycle and high extracellular matrix activity. This work detected that of all the evaluated genes, TMIGD1 was the one with the greatest under-expression in patients as compared to controls. Even though ileal transcriptome did not show differences in expression between patients with and those without PSR, those presenting PSR showed a lower protein level as compared to patients without PSR in the short term follow-up. TMIGD1 in the terminal ileum is predominately the isoform 2: 24kDa, which is not glycosylated and which is localized in the microvilli of polarized and well-differentiated epithelial cells. Furthermore, PSR presented several under-expressed biologic functions, among which one of the highlights is the Notch pathway. In this pathway, several proteins (S100A8, CYCLIN D1, NOTCH2, CEACAM, HNFAG) showed increased expression in patients who developed PSR, except TGFβ1, which was decreased, and which may correspond to lower modulation in cell differentiation in the intestinal epithelium. Indeed, characterization of epithelial cell lineages showed no significant changes in any traits, except goblet cells, which were found to be significantly increased in the ileal crypt of patients that presented that later presented PSR. CONCLUSIONS: This is the first time TMIGD1 has been studied in CD, where it seems to be related to differentiation and restoration of intestinal epithelium homeostasis. PSR appears to involve the loss of the homeostatic balance between proliferation and differentiation, with an inhibition of the Notch signalling pathway. An increase in goblet cells in the intestinal crypts of the resected terminal ileum may predict PSR.