Computational modeling of fluorescent markers for amyloid detection

Abstract

La marca distintiva principal de la enfermedad de Alzheimer es la deposición en el cerebro de fibras que resultan de la agregación del amiloide-β, un péptido hidrofóbico de 40 o 42 aminoácidos. En los últimos años, se ha dedicado mucho esfuerzo al desarrollo de técnicas de fluorescencia para la detección de fibras amiloides in vivo. La peculiar arquitectura “cross-b” de las fibras genera canales, definidos por las cadenas laterales de los residuos hidrofóbicos, que pueden alojar moléculas pequeñas que pueden actuar como marcadores fluorescentes Dado que el objetivo es la detección de agregados amiloides, el interés está en detectar selectivamente la fluorescencia emitida por los marcadores enlazados con las fibras amiloides. Paraello, los marcadores deben sufrir importantes modificaciones en sus espectros de fluorescencia cuando éstos se enlacen con las fibras. A pesar de que se hayan propuesto muchas clases de marcadores en los últimos 10 años, todavía no se conocen profundamente los orígenes de estos cambios en los espectros de fluorescencia. En esta tesis se estudian tanto las propiedades fotofísicas de los marcadores fluorescentes como su interacción con las fibras amiloides mediante un conjunto de técnicas computacionales. Los resultados obtenidos indican que los cambios en los espectros de fluorescencia pueden atribuirse a una variedad de fenómenos. Por ejemplo, los marcadores pueden sufrir procesos de agregación-desagregación, es decir, en disolución, los agregados formados espontáneamente no emiten fluorescencia, mientras que en presencia de fibras se recupera una sola molécula, que sí puede emitir. Por otra parte, algunos de estos marcadores se pueden desactivar a través de un cruce intersistema, cuya eficiencia depende de la polaridad del medio. De esta manera, cuando la molécula se transfiere desde el medio biológico, que es esencialmente una disolución acuosa, al núcleo hidrofóbico de la fibra, se modifica la velocidad de cruce intersistema, y consecuentemente, el rendimiento cuántico de la fluorescencia. Por último, dado que estos marcadores fluorescentes contienen enlaces dobles, pueden existir intersecciones cónicas correspondientes a torsiones de 90 grados alrededor de estos enlaces que den lugar a una desactivación no radiativa. Estas torsiones se pueden producir libremente cuando la molécula está en disolución. Sin embargo, el impedimento estérico existente en el interior de la fibra hace que éstas sean más difíciles, si no imposibles, reduciendo la eficiencia de conversión interna y aumentando la fluorescencia. Estas observaciones permiten racionalizar el comportamiento de estos marcadores y guiar el diseño de la síntesis de nuevos marcadores con rendimiento óptimo.

The main hallmark of Alzheimer's disease is the deposition in the brain of fibrils resulting from the aggregation of amyloid-β, a hydrophobic peptide composed of 40 or 42 aminoacids. In recent years, a lot of interest has been devoted to the development of fluorescence imaging techniques that allow the in vivo detection of amyloid fibrils. The peculiar cross-β architecture of amyloid fibrils yields channel-shaped binding pockets, defined by the side chains of hydrophobic residues, which can accommodate small molecules that can act as fluorescent markers. Since the aim is to detect amyloid aggregates, the interest relies in collecting selectively the fluorescence emitted by markers that are actually bound to amyloid fibrils, and not by free molecules. In this regard, fluorescent markers should undergo important variations of their fluorescence spectra upon binding to amyloid fibrils. Despite the fact that several classes of fluorescent markers have been proposed over the last 10 years, little is known about the origin of these spectral modifications.

In this thesis, both the photophysical properties of fluorescent markers and their binding to amyloid fibrils were studied using a pool of computational techniques. A deep understanding of these phenomena is essential for the rational design of markers with tailored properties. Results indicate that a variety of properties may be responsible for these spectral modifications occurring upon binding to amyloid fibrils. For instance, the markers may undergo an aggregation-disaggregation process, which is accompanied by an important enhancement of fluorescence intensity. This can be explained considering that while the fluorescence of spontaneously formed aggregates of these markers is quenched in aqueous solution, in the presence of amyloid fibrils they disaggregate, yielding the single, emitting, marker molecule. Some of these markers may also undergo intersystem-crossing, whose efficiency has been demonstrated to be strongly affected by the polarity of the environment. In this way, when the molecule moves from the polar biological medium, which is essentially an aqueous solution, inside the hydrophobic core of amyloid fibrils, the rate of intersystem crossing changes, and with it the quantum yield of fluorescence. Last, since these fluorescent markers contain double bonds, conical intersections corresponding to torsions of 90 degrees around the double bonds can lead to non-radiative deactivation. While these torsions are relatively easy for the free molecule, they become hindered, if not impossible, when the marker is packed inside amyloid fibrils. This reduces the efficiency of internal conversion upon binding, which in turn enhances fluorescence. These findings allow the rationalization of the spectroscopical behavior of these markers and can guide the design of new markers with improved performances.