L’increment de la dosi gènica com a estratègia de millora de la producció de proteïnes recombinants al llevat Pichia pastoris: revertint les limitacions genètiques del sistema biològic

Abstract

La producció de proteïnes recombinants ha esdevingut la opció predilecta per la producció de productes biofarmacèutics i enzims industrials. Com a factories cel·lulars, els llevats presenten nombroses avantatges enfront d’altres microorganismes, com la seva capacitat per realitzar modificacions post-traduccionals a les proteïnes, l’ampli ventall d’eines genètiques i la facilitat per créixer a altes densitats, entre d’altres. En aquest context, la idoneïtat del llevat metilotròfic Pichia pastoris en la producció de proteïnes recombinants ha destacat per sobre del llevat clàssic Saccharomyces cerevisiae, presentant una rellevància creixent en la producció de productes comercials recombinants. Entre d’altres factors, la presència del promotor AOX1 (PAOX1), d’expressió elevada i fortament regulat pel metanol, ha contribuït a la popularitat d’aquest sistema d’expressió. Per tal de millorar la producció de proteïna recombinant, s’han provat diverses estratègies, sent l’increment de la dosi gènica una de les més populars. Tot i que es pot obtenir una millora de la productivitat heteròloga amb aquesta metodologia, elevades dosis gèniques normalment comporten una sobrecàrrega metabòlica que deriva en productivitats baixes. Durant el transcurs d’aquesta tesi, s’ha utilitzat la lipasa de Rhizopus oryzae (Rol) com a proteïna model, expressada sota el control de PAOX1. Primer, es va construir una col·lecció de soques de P. pastoris amb un nombre creixent de còpies de ROL, i es va descriure per primer cop l’ús de la ddPCR (de l’anglès Droplet Digital PCR) per la determinació acurada de la dosi gènica a P. pastoris, demostrant una precisió més elevada que amb l’ús de la qPCR (de l’anglès quantitative real-time PCR) convencional. Segon, es va realitzar un estudi transcriptòmic mitjançant microarrays d’un grup de soques multicòpia, per tal d’entendre millor l’impacte de la dosi gènica de ROL a les rutes metabòliques. Concretament, les dades van revelar una forta regulació negativa de les rutes relacionades amb el metanol (entre d’altres), en consonància amb les dades fisiològiques obtingudes, que mostraven que les taxes de consum de la font de carboni i el creixement cel·lular eren dependents del nombre de còpies. A partir d’aquestes observacions, es va modificar una soca amb 4 còpies de ROL per tal que expressés una variant desregulada del factor de transcripció Mxr1, principal regulador de la ruta del metanol. Les dades fisiològiques i els nivells transcripcionals dels principals gens implicats en el metabolisme del metanol van confirmar la millora en la producció de Rol i l’increment en l’expressió dels gens relacionats amb el metanol i ROL. Finalment, es va dur a terme un estudi comparatiu a nivell transcriptòmic de la resposta de P. pastoris a l’expressió de tres proteïnes recombinants diferents, per tal d’estudiar l’impacte de la complexitat proteica i l’ús de sistemes d’expressió constitutius o induïbles. En resum, el present estudi descriu per primera vegada una aproximació a nivell de sistema de l’impacte d’una dosi gènica creixent en el llevat P. pastoris, permetent així el disseny de noves estratègies d’enginyeria cel·lular per tal de generar soques més productores, mitjançant la biologia sintètica i l’enginyeria metabòlica.

Recombinant protein production is becoming the preferred option to synthesized biopharmaceutical and industrial enzymes. As a host system, yeast factories provide numerous advantages over other microorganisms, such as their capacity to perform post-translational protein modifications, the wide genetic available tools, and the facility to growth at high densities, among others. In this context, the suitability of methylotrophic yeast Pichia pastoris for recombinant protein production has stand out over the classical yeast Saccharomyces cerevisiae, presenting an increasing relevance for the production of commercial recombinant products. Among several factors, the presence of the strong and tightly regulated AOX1 promoter (PAOX1) has contributed to the popularity of this expression system. To further increase the recombinant protein production, several strategies have been attempted, being the increase of the heterologous gene dosage one of the most widely reported. Although a heterologous productivity improvement can be achieved with this methodology, high gene dosages normally entail a metabolic burden in the cell that results in lower productivities. In the course of this thesis, it has been used the lipase of Rhizopus oryzae (Rol) as a protein model expressed under the control of the PAOX1. Firstly, we constructed a series of P. pastoris strains harbouring an increase gene dosage of ROL, and we reported for the first time the use of Droplet Digital PCR (ddPCR) for an accurate copy number determination in P. pastoris, allowing a higher precision than using conventional quantitative real-time PCR (qPCR). Secondly, a transcriptomic study of a set of multicopy strains was carried out using microarrays, to better understand the impact of ROL gene dosage on the metabolic pathways. Concretely, transcriptomic data revealed a high downregulation of methanol-related pathways (among others), in agreement with the physiological data that had been showed that C-source uptake rate and growth yields were gene dosage dependents. Based on these observations, a strain carrying 4 copies of ROL was remodified to express a deregulated variant of the Mxr1 transcription factor, the main regulator of methanol metabolism. Physiological data and transcriptional levels of the main genes involved in methanol metabolism confirmed the improvement of Rol production and the increasing expression levels of methanol-related genes and ROL. Finally, it was performed a comparative transcriptomic analysis of the response of P. pastoris to the expression of three different recombinant proteins, to study the impact of protein complexity and the use of constitutive or inducible expression systems. Overall, in the present study we describe the first systems-level approach to determine the impact of increasing gene dosage in the yeast P. pastoris, hence allowing the design of novel cell engineering strategies to generate high-producing strains by means of the synthetic biology and metabolic engineering.