Complejidad de la cuasiespecie del virus de la hepatitis B en la región X/preCore: asociación con la evolución de la infección con y sin tratamiento antiviral

Abstract

El Virus de la hepatitis B (VHB) tiene una tasa de mutación de 3,2×10-5 – 7,9×10-5 nucleótidos sustituidos/ciclo replicativo, esto se debe a que este ciclo consta de un paso de retrotranscripción llevado a cabo por una transcriptasa reversa que carece de actividad correctora de errores exonucleasa 3’-5’. Este hecho resulta en una enorme diversidad genética en forma de genotipos, subgenotipos, cuasiespecies (QS) y variantes en diferentes regiones del genoma. Existen numerosas evidencias de la relación entre la diversidad genética del VHB, e incluso de la complejidad de la QS, y la tasa de seroconversión HBeAg, los niveles de ADN-VHB, el escape inmune, la patogénesis y la respuesta al tratamiento, lo que pone de manifiesto la relevancia de estudiar dicha variabilidad y complejidad. El objetivo de este proyecto de tesis fue evaluar la complejidad de la QS en la región preCore/Core y su relación con el estatus HBeAg, y analizar los cambios en la QS durante la dinámica natural y bajo el tratamiento con análogos de nucleós(t)idos (NUCs), a través de los parámetros de complejidad (entropía de Shannon normalizada, frecuencia de mutación y diversidad nucleotídica). El segundo objetivo fue estudiar la complejidad a nivel de genotipos mediante la evaluación de la presencia de mezclas y sus consecuencias, en dos regiones del genoma (polimerasa/superficie y X/preCore) en pacientes con infección crónica, también durante dos períodos (dinámica natural y tratamiento con NUCs). Para ello en el primer estudio se llevó a cabo la secuenciación masiva por UDPS (ultra-deep pyrosequencing) de la región preCore/Core en muestras secuenciales (en el momento del diagnóstico, tras un tiempo sin tratamiento y después de no responder al mismo) de 10 pacientes seleccionados y agrupados según su estatus HBeAg. En el segundo estudio se analizaron muestras de otros 10 pacientes en la región polimerasa/superficie y X/preCore en una muestra basal, tras un tiempo sin tratamiento y durante el tratamiento, el genotipo se determinó por filogénesis. Los resultados del primer estudio revelan mayor complejidad de la QS en pacientes HBeAg(-) que HBeAg(+), confirmando estudios previos. Los resultados también muestran que la alta complejidad en la región preCore está asociada con una baja replicación, en concordancia con el papel clave de esta región en la misma, y sugiere una respuesta inmune aumentada en los pacientes HBeAg(-), probablemente debido a la falta de actividad inmunomoduladora de HBeAg. La selección positiva de variantes core en pacientes HBeAg o fluctuante que se ha observado, puede ser entendida como un mecanismo potencial de escape del sistema inmune por cambios en la secuencia de la nucleocápside. Por último, se ha encontrado una correlación negativa de la evolución de la QS en el período sin tratamiento y en el período con tratamiento, lo que sugiere la importancia de estudiar la complejidad de la QS antes de tratar a los pacientes como un posible factor predictivo de la evolución del virus en el caso de no respondedores a NUCs. Los resultados del segundo estudio evidencian infecciones con mezclas de genotipos y su cambio a lo largo del tiempo y ponen de manifiesto la compleja dinámica de la QS del VHB como un mecanismo adicional para adaptarse a nuevas situaciones, como pueden ser la repuesta del sistema inmune o un determinado tratamiento antiviral. Se han encontrado discrepancias entre los genotipos obtenidos en la región polimerasa/superficie y X/preCore que sugieren un fenómeno de recombinación intergenotípica y que señalan la necesidad de consensuar una región y técnica para el genotipaje, que lleve a una mejor comprensión del significado clínico de la clasificación genotípica.

Hepatitis B Virus (HBV) shows a high mutation rate (3.2 × 10-5 - 7.9 × 10-5 nucleotide substitutions/replicative cycle), due to its unique life cycle which requires an error-prone reverse transcriptase for replication. This fact results in a tremendous genetic variation in the form of genotypes, sub-genotypes, quasispecies (QA) and variants in different regions of the genome. There has been considerable evidence on the relationship between HBV genetic variation, or even QA complexity, and HBeAg seroconversion, HBV-DNA levels, immune scape, pathogenesis and treatment response, showing the relevance of the analysis of this variability and complexity. The aim of this thesis project was to evaluate HBV QA complexity in the preCore/Core regions in relation to HBeAg status, and explore QA changes under natural evolution and nucleoside analogue (NUCs) treatment, measuring complexity parameters (normalized Shannon entropy, mutation frequency and nucleotide diversity). The second aim was to study the complexity at genotype level by assessing the presence and outcome of genotype mixtures in the polymerase/surface and X/preCore regions in patients with chronic hepatitis B virus, also during two periods (natural evaluation and NUCs treatment). For this purpose ultra-deep pyrosequencing (UDPS) of HBV preCore/Core regions in sequential samples (baseline at moment of diagnosis, after a period treatment-free, and after a period of treatment-nonresponse) from 10 retrospectively selected patients grouped according to HBeAg status, were analyzed in the first study. In the second study, thirty samples from another ten chronic hepatitis B patients were analyzed in the polymerase/surface and X/preCore regions in the first available sample at diagnosis, a pre-treatment sample, and a sample while under treatment and the HBV genotype was determined by phylogenesis. The results of the first study provided confirmatory data for previous studies indicating greater QA variability in HBeAg(-) than HBeAg(+) patients. The results show that high complexity in the preCore region is associated with low viral replication, in keeping with the key role of this region in HBV replication, and suggest an enhanced immune response in HBeAg(-) patients, probably related to the lack of HBeAg immunomodulatory activity. In the same direction, the positive selection of Core variants in HBeAg(-) and fluctuating status patients found in this study, can be understood as a potential mechanism to escape the host immune system by nucleocapsid sequence changes. Finally, the strong negative correlation of QA evolution in the treatment-free period and under treatment shows the importance of studying the QA before treating patients, as a potential predictive factor of HBV evolution in cases of NUC nonresponse. The results of the second study provides evidence of HBV genotype mixtures that change over time and illustrates the complex dynamics of the HBV quasispecies as an additional mechanism when adapting to new situations, such as host immune response and/or antiviral treatment. Discrepancies between genotypes in the polymerase/surface and X/preCore regions suggest phenomena of intergenotype recombination and indicate the need for a consensus effort to set an HBV genotyping approach that will lead to a more comprehensive understanding of the clinical significance of HBV genotype classification.