ADN lliure en plasma matern: marcadors d’ADN fetal i detecció d’anomalies cromosòmiques d’origen patern

Abstract

El descobriment de la presència d’ADN fetal lliure en plasma matern, l’any 1997, va suposar el punt de partida per al desenvolupament dels tests prenatals no invasius. Les molècules d’ADN fetal s’observen en plasma de les gestants des del primer trimestre d’embaràs en endavant, i poden ser detectades i analitzades de manera eficient mitjançant una varietat de mètodes moleculars altament evolucionats i implementats en la gestió de l’embaràs en diversos països. Un dels desafiaments inicials va ser la identificació de marcadors epigenètics universal que permetessin la detecció d’ADN del fetus independentment del origen parental (matern o patern) o sexe fetal. Amb aquest objectiu, en el present estudi, s’han explorat les diferències epigenètiques en placenta (fetus) i sang materna per caracteritzar marcadors epigenètics universals. Utilitzant test de PCR específics s’han identificat diverses seqüències amb diferents patrons de metilació entre els dos teixits esmentats. També s’ha investigat la utilització de microsatèl·lits altament polimòrfics per la detecció inequívoca d’ADN fetal en plasma matern i s’ha desenvolupat tests de PCR Múltiplex Fluorescent que han estat utilitzats amb èxit en casos clínics. L’èxit obtingut ens ha permès establir una base de dades de marcadors seleccionats al llarg de tots els cromosomes, per ser utilitzats en diagnòstic prenatal no invasiu en famílies portadores de diverses anomalies cromosòmiques d’origen patern. S’han analitzat cinc famílies que han estat correctament diagnosticades, incloent un cas clínic realitzat per confirmar el diagnòstic genètic preimplantacional. La base de dades dels marcadors desenvolupada, junt amb l’elevada sensibilitat de la PCR Múltiplex Fluorescent, ha esdevingut de gran valor clínic donat que ha permès un diagnòstic prenatal exitós en els casos estudiats sense necessitar mètodes invasius.

The discovery of fetal DNA in the plasma of pregnant women, in 1997, opened up new perspectives in the research field of non invasive prenatal diagnosis. Fetal DNA molecules can be detected early in the 1st trimester of pregnancy and can be analysed with a variety of advanced molecular tests, which are already part of clinical routine in several countries. One of the first difficulties encountered has been the identification of genetic universal markers, allowing detecting fetal DNA independently from parental origin or fetal sex. With this objected, in the course of this study, we explored epigenetic differences between placenta (fetal) and maternal blood, in order to develop epigenetic universal markers. Using methylation specific PCR assays, several sequences with differential methylation patterns have been identified in these tissues. We also investigate the suitability of using highly polymorphic microsatellites to detect unequivocally fetal cfDNA in maternal plasma and developed multiplex fluorescent PCR assays which were successfully used in clinical cases. The proven efficiency of this approach allowed establishing a marker database with suitable sequences selected along all chromosomes, to be used for non invasive prenatal diagnosis in families with paternal translocations. Five families analysed in the course of this study could correctly be diagnosed, including one clinical case performed to confirm preimplantation genetic diagnosis. The database of markers developed coupled with the high sensitivity of multiplex fluorescent PCR proved of great clinical utility, allowing prenatal diagnosis to be performed successfully in selected cases, without the need of invasive procedures.