Unveiling the multifaceted antimicrobial mechanism of action of human host defence RNases

Abstract

La presente tesis doctoral se encuentra integrada dentro del estudio a gran escala de la estructura-función de las ribonucleasas antimicrobianas humanas. Estas proteínas catiónicas y de bajo peso molecular son secretadas por la mayoría de los organismos vertebrados agrupándose dentro la superfamilia de la ribonucleasa A, una de las enzimas mejor caracterizadas del siglo XX. De interés remarcable podríamos considerar su amplio abanico de propiedades biológicas, teniendo en cuenta su diverso historial de propiedades biológicas no catalíticas, convirtiéndolas en un buen modelo de proteínas multifunción. Junto a su principal característica como enzima catalizador de ácidos ribonucleicos, es importante destacar también otro tipo de propiedades biológicas no menos esenciales, como su actividad antimicrobiana, que comparten miembros distantes de la familia sugiriendo una función ancestral en el sistema inmune. Además, se ha visto que la expresión de algunas RNasas humanas puede ser inducida en procesos infecciosos. En particular, las RNasas estudiadas en este trabajo, las RNasas humanas 3, 6 y 7, se expresan principalmente en eosinófilos, monocitos y células epiteliales, respectivamente. Estas proteínas muestran una alta cationicidad debido a su alta proporción de residuos básicos y una notable actividad antimicrobiana frente a una amplia gama de patógenos humanos. Nuestro grupo de investigación posee una larga trayectoria en el estudio del mecanismo de acción de las ribonucleasas humanas y el trabajo teórico-experimental que se presenta en esta tesis ha contribuido a consolidar el actual proyecto de investigación. Los principales avances llevados a cabo por la presente tesis doctoral se enumeran a continuación:

- La caracterización del mecanismo antimicrobiano de la ribonucleasa 6, evaluando sus propiedades microbicidas frente a patógenos y modelos de membrana. Concretamente se ha revelado su actividad aglutinadora además de demostrarse que su actividad antimicrobiana está localizada básicamente en su extremo Nterminal. - La resolución de la primera estructura tridimensional de la ribonucleasa 6, obtenida a 1.72 Å, que ha permitido asentar las bases estructurales para futuros estudios funcionales. Análisis complementarios sobre su caracterización cinética y predicción de complejos con diferentes ligandos han revelado sitios de unión y de catálisis que posteriormente han sido confirmados mediante mutagénesis dirigida. - El estudio de la efectiva actividad antipatogena a nivel intracelular que presentan las ribonucleasas 3,6 y 7 asi como sus péptidos derivados N-terminales frente a micobacterias en un modelo de macrófagos infectados. - La expansión del conocimiento sobre las bases antipatogenas de diferentes péptidos y proteínas antimicrobianas que participan en la erradicación de las infecciones por micobacterias, asi como las terapias derivadas. - La caracterización del mecanismo antimicrobiano de los 8 peptidos N-terminales derivados de las ribonucleasas frente a Candida albicans, como modelo de patógeno eucariota

Como conclusión, los resultados presentados en esta tesis contribuyen a profundizar en la comprensión de las bases moleculares del papel que desempeñan algunas ribonucleasas en el sistema inmune y expandir el proyecto al diseño de agentes terapéuticos basados en péptidos antimicrobianos con el objetivo de erradicar enfermedades infecciosas causadas por patógenos resistentes.

The present doctoral thesis is integrated into the large-scale study of the structure and function of human antimicrobial ribonucleases. These cationic and low molecular weight proteins are grouped into the ribonuclease A superfamily, considered one of the best characterized enzymes of the twentieth century. The RNase A superfamily is specific for vertebrates and has attracted remarkable interest due to the diversity of displayed biological properties; and represents an excellent example of a multifunctional protein´s family. Together with the main enzymatic activity we must highlight other biological properties such as the angiogenic, immunomodulatory and antimicrobial activities. The reported antimicrobial activity of distantly related family members in early vertebrates suggests that the family arouse with an ancestral function in host defence. Besides, the expression of several human RNases has been reported to be induced by infection. In particular, the RNases studied in this work, the human RNases 3, 6 and 7, are mainly expressed in eosinophils, monocytes and epithelial cells respectively. These proteins show a high cationicity due to the high proportion of basic residues and a remarkable antimicrobial activity against a wide range of human pathogens. Our research group has a consolidated experience in the study of the mechanism of action of human ribonucleases and the experimental work presented in this thesis is contributing to this overall research project. The main results achieved by the present PhD study are outlined below:

- The characterization of the antimicrobial mechanism of RNase 6, both in bacteria cell cultures and using membrane models. Results highlight that the antimicrobial and cell agglutinating activities are mainly located at the N-terminus. - The resolution of the first three-dimensional structure of ribonuclease 6, obtained at 1.72 Å, which has set the structural basis for future functional studies. The kinetic characterization of RNase 6 mutant variants and the prediction of protein- substrate complexes have identified the enzyme nucleotide binding sites. - The study of the intracellular activity of ribonucleases 3, 6 and 7 and their derived Nterminal peptides against intracellular resident mycobacteria using a macrophage infected model. - The analysis of the anti-pathogenic mechanism of action of human antimicrobial proteins and peptides in mycobacterial infections and their applied therapies. - The comparative characterization of the antimicrobial mechanism of action of human RNases and their N-terminal derived peptides towards Candida albicans, as an eukaryote pathogen model.

The results presented in this thesis will contribute to the understanding of the role of human RNases in the immune system and provide the structure- function basis to expand the initial project into the design of novel peptide mimetic therapeutics agents towards the eradication of resistant infectious diseases.