Scaling up recombinant BCG based HIV vaccine development. Lessons learned

Abstract

El treball de recerca realitzat en aquesta Tesi Doctoral està dirigit a la millora del desenvolupament de la vacuna contra el VIH basada en BCG recombinant. La Tesi Doctoral inclou tres articles de recerca publicats en revistes “peer-reviewed” i una patent depositada a la Oficina Europea de Patents. Inicialment, hem avaluat la influencia de l’edat i la ruta d’immunització en la inducció de respostes immunes especifiques front a VIH i M. tuberculosis després d’immunitzar ratolins BALB/c recent nascuts i adults amb BCG.HIVA222 i reforçar-los amb Modified Virus Ankara (MVA).HIVA. Les freqüències de cèl·lules CD8+ productores de IFN- γ eren superiors en ratolins adults vacunats per via intradèrmica i menors en ratolins adults i recent nascuts vacunats per via subcutànea. En tots els casos la producció de IFN-γ era significativament superior en ratolins induïts amb BCG.HIVA222 en comparació dels ratolins induïts amb BCGwt. Quan l’activitat Citotòxica dels limfòcits T (CTL) específica pel VIH es va comprovar, les freqüències de toxicitat específica eren superiors en ratolins recent nascuts que en ratolins adults. El programa vacunal d’inducció-reforç heteròleg amb BCG.HIVA222 i MVA.HIVA va ésser segur en ratolins recent nascuts. L’administració de BCG.HIVA222 a ratolins recent nascuts és segura i immunogènica i va augmentar la resposta específica front a VIH induïda per la vacuna MVA.HIVA. Seguidament, vàrem construir el pJH222.HIVACAT, un plasmidi llançadora que expressava l’immunogen de VIH subtipus A HIVA. Aquest vector llançadora utilitza un mecanisme lliure de resistències a antibiòtic basat en un sistema de Titració del Repressor de l’Operador (ORT) per la selecció i manteniment del plasmidi en cèl·lules E. coli i una complementació de lisina en micobactèria. Aquest vector llançadora es va electroporar una soca de BCG auxotròfica per lisina per generar la soca vacunal BCG.HIVACAT. Vàrem demostrar que el plasmidi episomal pJH222.HIVACAT era estable in vivo per un període de 20 setmanes, i vàrem caracteritzar genèticament i fenotípica la soca vacunal BCG.HIVACAT. La vacuna BCG.HIVACAT en combinació amb MVA.HIVA indueix una resposta de cèl·lules T productores de IFN- γ especifiques per VIH i M. tuberculosis. Per altra banda, quan es varen induir ratolins adults amb BCG.HIVACAT i es varen reforçar amb MVA.HIVA.85A, es varen induir cèl·lules T CD8+ especifiques per VIH que produïen IFN-γ, TNF-α, IL-2 i CD107a al ésser estimulades. Per tant, vàrem demostrat la immunogenicitat per cèl·lules T de una nova vacuna, més segura, compatible amb GLP, basada en BCG recombinant que expressa l’immunogen prototipus HIVA. Finalment, hem construït un nou disseny de vacuna basada en micobactèria mitjançant la utilització d’un sistema de selecció de plasmidis lliure de resistència a antibiòtics. Hem construït un nou plasmidi llançadora per E. coli i micobactèria que expressa l’immunogen HIVA. Aquest vector llançadora utilitza un sistema de selecció i manteniment de plasmidis sense resistències a antibiòtics, que es basa en la complementació de glicina en E. coli i la complementació de lisina en micobactèria. Aquest plasmidi primer es va tranformar en una soca d’E. coli auxotròfica per glicina, i llavors es va transformar en una soca de BCG auxotròfica per lisina per generar la soca vacunal BCG. HIVA2auxo. Vàrem demostrar que el plasmidi episomal p2auxo.HIVA era estable in vivo per un període de 7 setmanes, i vàrem fer la caracterizació genètica i fenotípica de la soca vacunal BCG.HIVA2auxo. La vacuna BCG.HIVA2auxo, en combinació amb MVA.HIVA, va ésser segura i va produir cèl·lules T productores de IFN-γ especifiques per VIH i M. tuberculosis en ratolins BALB/c adults. Es varen induir cèl·lules T CD8+ polifuncionals especifiques per VIH que produïen IFN-γ, TNF-α i expressaven el marcador de degranulació CD107a. Així, hem construït una nova vacuna basada en BCG més segura i compatible amb les GLP fent servir l’immunogen HIVA. Aquests sistema de selecció de plasmidis lliure de resistències a antibiòtics basat en la doble complementació d’auxotrofies podria ésser una nova plataforma vacunal micobacteriana per desenvolupar no només BCG recombinant que expressa immunògens de VIH de segona generació, sinó també d’altres patògens d’interès pediàtric per induir resposta protectiva just després de néixer.

The research work of this PhD thesis aims to scale up recombinant BCG based HIV vaccine development. Our main goal is to develop a mycobacterial vaccine design for HIV-TB pediatric vaccine. The PhD thesis includes three research papers published in peer-reviewed journals and one patent filed in the European patent office. Initially, we have evaluated the influence of age and immunization routes for induction of HIV-1- and M. tuberculosis-specific immune responses after neonatal and adult BALB/c mice immunization with BCG.HIVA222 prime and Modified Virus Ankara (MVA).HIVA boost. The frequencies of HIV-specific CD8+ T cells producing IFN-γ were higher in adult mice vaccinated intradermally and lower in adult and newborn mice vaccinated subcutaneously. In all cases the IFN-γ production was significantly higher when mice were primed with BCG.HIVA222 compared with BCGwt. When the HIV-specific Cytotoxic T-lymphocytes (CTL) activity was assessed, the frequencies of specific killing were higher in newborn mice than in adults. The prime-boost vaccination regimen which includes BCG.HIVA222 and MVA.HIVA was safe when inoculated to newborn mice. The administration of BCG.HIVA222 to newborn mice is safe and immunogenic and increased the HIV-specific responses induced by MVA.HIVA vaccine. Secondly, we assembled an E. coli-mycobacterial shuttle plasmid pJH222.HIVACAT expressing HIV-1 clade A immunogen HIVA. This shuttle vector employs an antibiotic resistance-free mechanism based on Operator-Repressor Titration (ORT) system for plasmid selection and maintenance in E. coli and lysine complementation in mycobacteria. This shuttle plasmid was electroporated into parental lysine auxotroph strain of BCG to generate vaccine BCG.HIVACAT. We demonstrated that the episomal plasmid pJH222.HIVACAT was stable in vivo over a 20-week period, and genetically and phenotypically characterized the BCG.HIVACAT vaccine strain. The BCG.HIVACAT vaccine in combination with MVA.HIVA induced HIV-1- and Mtb-specific IFN-γ- producing T-cell responses in newborn and adult BALB/c mice. On the other hand, when adult mice were primed with BCG.HIVACAT and boosted with MVA.HIVA.85A, HIV-1-specific CD8+ Tcells producing IFN-γ, TNF-α, IL-2 and CD107a were induced. Thus, we demonstrated T-cell immunogenicity of a novel, safer, GLP-compatible BCG-vectored vaccine using prototype immunogen HIVA. Finally, we have engineered a new mycobacterial vaccine design by using an antibiotic-free plasmid selection system. We assembled a novel Escherichia coli (E. coli)-mycobacterial shuttle plasmid p2auxo.HIVA expressing the immunogen HIVA. This shuttle vector employs an antibiotic resistance-free mechanism for plasmid selection and maintenance based on glycine complementation in E. coli and lysine complementation in mycobacteria. This plasmid was first transformed into glycine auxotroph of E. coli strain and subsequently transformed into lysine auxotroph of Mycobacterium bovis BCG strain to generate vaccine BCG.HIVA2auxo. We demonstrated that the episomal plasmid p2auxo.HIVA was stable in vivo over a 7-week period and genetically and phenotypically characterized the BCG.HIVA2auxo vaccine strain. The BCG.HIVA2auxo vaccine in combination with MVA.HIVA was safe and induced HIV-1 and Mycobacterium tuberculosis-specific IFN-γ-producing T-cell responses in adult BALB/c mice. Polyfunctional HIV-1-specific CD8+ T-cells, which produce IFN-γ and TNF-α and express the degranulation marker CD107a, were induced. Thus, we engineered a novel, safer, good laboratory practice-compatible BCG-vectored vaccine using prototype immunogen HIVA. This antibiotic-free plasmid selection system based on "double" auxotrophic complementation might be a new mycobacterial vaccine platform to develop not only recombinant BCG-based vaccines expressing second generation of HIV-1 immunogens but also other major pediatric pathogens to prime protective response soon after birth.