Estudio de complejidad y evolución del gen NS3 del virus de la hepatitis C (VHC) mediante ultra-deep pyrosequencing (UDPS) en pacientes expuestos al mismo inóculo viral

Abstract

El objetivo principal del trabajo desarrollado en esta tesis doctoral ha sido el estudio de la variabilidad del virus de la hepatitis C (VHC) en diferentes situaciones clínicas y desarrollar técnicas de estudio adecuados para lograr este objetivo. En el primer trabajo se estudió la diversificación a lo largo del tiempo del gen NS3 en un paciente con infección crónica, y las características de la población viral antes y después de la transmisión del virus por vía sexual a su pareja sana, empleando las técnicas de clonación y secuenciación clásicas de Sanger. Este trabajo demostró que esta vía de transmisión supone un cuello de botella (“bottleneck”) debido a la transmisión de un número muy reducido de partículas virales. En el segundo trabajo se realizó el análisis de mutaciones de resistencia a inhibidores antivirales en pacientes con infección crónica por VHC que no habían recibido tratamiento. La presencia de mutaciones que confieren resistencia a antivirales en un paciente no tratado con antivirales es una consecuencia directa de la continua generación de variantes, y este hecho representa un inconveniente importante en el tratamiento anti-viral. De ahí surge la necesidad de caracterizar el perfil de resistencia de la quasiespecies viral en pacientes con infección por VHC antes de iniciar el tratamiento. Dada la limitación de las técnicas de clonación y secuenciación por Sanger y la dificultad de poder ser empleadas en la rutina diagnóstica, se propuso como objetivo del tercer trabajo, el estudio de estas poblaciones virales mediante las técnicas de secuenciación masiva, concretamente mediante el uso de la plataforma 454 GS-FLX. En el tercer trabajo, se puso a punto la tecnología aplicada al VHC empezando por los controles con clones para averiguar la sensibilidad y fiabilidad de la técnica. El objetivo de este trabajo fue estudiar factores virales y del paciente que podrían ayudar a explicar la evolución hacia cronicidad o resolución espontánea. Debido a la importancia del tamaño del inóculo viral que se transmite, se estudiaron 3 rutas diferentes de transmisión del VHC comparando la fuente (paciente crónico) y el receptor: (i) transmisión de un número pequeño partículas por cuello de botella (pacientes A y B), (ii) transmisión de un número indeterminado de virus (pacientes C y D) (iii) transmisión masiva de partículas después de un trasplante de hígado en un paciente infectado por VHC (paciente Epre y Epost). De este trabajo, se concluye que la secuenciación masiva asociada a la especificidad de la respuesta inmune CD4 frente a la región carboxi-terminal de la proteína NS3 del VHC puede estar implicada en la evolución de la infección hacia cronicidad o hacia resolución espontánea. El paciente con infección aguda que resolvió la infección de manera espontánea, mostró un comportamiento diferente en esta región carboxi-terminal de NS3, a la observada en los pacientes crónicos y en los casos de nueva infección que evolucionaron hacia cronicidad. El análisis en profundidad de miles de secuencias de la población viral da una imagen más precisa del comportamiento de las poblaciones virales, y podría permitir diseñar herramientas para el diagnóstico molecular, con el objetivo de conseguir tratamientos más personalizados de la infección por VHC.

The main topic in this thesis has been to study the variability of hepatitis C virus (HCV). This doctoral thesis has been developed in the Liver Disease Laboratory, Vall d’Hebron Institut de Recerca (VHIR). Two papers have been published and a third is under writing. In the first work, the diversification of the NS3 gene sequence in an HCV chronically infected patient and after accidental transmission to his host sexual partner was studied by cloning and Sanger sequencing. We demonstrated that transmission of HCV by sexual route causes a bottlenecking passage from patient to patient in which there is a transmission of a very small number of viral particles. In the second work we studied the presence of basal resistant mutations to antiviral inhibitors in patients with chronic HCV infection who had not received treatment. We detected a resistant mutation to most of the accepted and underdevelopment NS3 inhibitors. Basal detection of such mutations in naïve treated patients is a direct consequence of the continuous generation of variants. It has been demonstrated that this represents a significant drawback in the treatment of viral diseases suggesting the need to characterize the resistance profile of viral quasispecies in patients with HCV infection before starting specific treatment with direct antiviral agents (DAAs). Given the limitations of cloning and Sanger sequencing to be implemented as a routine diagnostic test, we studied the use of massive sequencing techniques by ultra-deep pyrosequencing (UDPS), especially through the use of the 454 GS-FLX platform to detect such minority mutants. In the third paper, we set up the UDPS technology using HCV controls. The aim of the third work was to adapt UDPS to the study of viral and patient predictive factors that could help explain the evolution to chronicity or spontaneous resolution after primary infection. Since the size of the transmitted viral inoculum size may be a key factor, we studied three different routes of transmission of HCV by comparing the source (chronic patient) and the recipient: (i) transmission a smaller number of particles per bottleneck (patients A and B), (ii) transmission of an unspecified number of viruses (patients C and D) (iii) massive transmission of particles after liver transplantation in HCV-infected patient (patient Epre and Epost). Summarizing, we observed that the massive sequencing data associated with specific CD4 immune response against C_terminal NS3 region may be important to evolve to either chronicity or spontaneous resolution of infection. The patient that self-spontaneously resolved acute HCV-infection had a different behavior in the C-terminal NS3 region than that observed in chronic patients and in cases of new infections that progressed to chronicity. The deep analysis of thousands of sequences of the viral population gives a more accurate picture of the HCV behavior, and could allow designing molecular tools for diagnosis, and personalized treatments for HCV infection.