Enzyme-Benzalkonium chloride combined strategies to remove Listeria monocytogenes mixed-species biofilms

Abstract

Listeria monocytogenes está considerada una de las bacterias patógenas transmitidas por alimentos de mayor relevancia en Europa. En la naturaleza, se encuentra formando biopelículas multiespecie, estructuras de resistencia constituidas por una matriz extracelular que actúa de barrera protectora frente a agentes externos, dificulta su acción y genera concentraciones subletales en el interior de la biopelícula. En el ámbito industrial, es habitual que las biopelículas estén expuestas a concentraciones subletales de biocidas, bien debido a que estas se encuentran en ubicaciones de difícil acceso, bien como consecuencia de una aplicación ineficiente. Ello favorece la aparición de bacterias resistentes y persistentes en plantas industriales, lo que ha llevado a un exceso en el uso de biocidas y al consecuente incremento del impacto ambiental. Es necesario, pues, proponer sistemas de limpieza y desinfección más efectivos y eficientes, que aseguren el control de patógenos, generen menor resistencia y mantengan los cánones de impacto ambiental. En la presente tesis se propone el diseño de un sistema de limpieza y desinfección específico frente a biopelículas mixtas de L. monocytogenes presentes en la industria alimentaria basado en la aplicación combinada de enzimas y cloruro de benzalconio (CB). La hipótesis de partida se basa en que la aplicación de las enzimas podría suponer la disrupción de la matriz de la biopelícula que actúa como barrera frente a antimicrobianos facilitando la acción posterior del desinfectante. La especificidad se consigue a partir de la caracterización previa de las biopelículas portadoras de L. monocytogenes presentes en la industria, que permite la selección de las enzimas, el ajuste de las dosis y el estudio del posible desarrollo de tolerancia. El trabajo se desarrolló en las siguientes etapas: • Caracterización de las comunidades portadoras de L. monocytogenes presentes en superficies de industrias pesquera, cárnica y láctica. Esto permitió detectar la presencia y subtipos de L. monocytogenes, caracterizar la microbiota acompañante y estudiar las dinámicas de adhesión de los aislados de L. monocytogenes sobre acero inoxidable (AI) así como la capacidad de su asociación y formación de biopelículas en cultivo mixto con las especies acompañantes.

• Efectividad de la combinación de enzimas-CB sobre la eliminación de biopelículas tempranas portadoras de L. monocytogenes. Se estudiaron los efectos de diferentes enzimas solas y combinadas con CB sobre biopelículas tempranas mixtas de L. monocytogenes formadas en AI. Los resultados obtenidos demostraron la efectividad de la aplicación combinada enzima-CB sobre la eliminación de biopelículas mixtas portadoras de L. monocytogenes y pusieron de manifiesto que dicha efectividad varía con la composición y edad de la biopelícula, señalando la importancia de diseñar sistemas específicos de limpieza y desinfección.

• Cuantificación de los efectos de la aplicación combinada de pronasa-CB sobre la eliminación de biopelículas tardías de L. monocytogenes-E. coli. Se cuantificaron los efectos individuales y combinados de la aplicación de pronasa y CB sobre la superficie ocupada por las biopelículas tardías mixtas y el número de células viables adheridas y desprendidas después de la aplicación de los tratamientos. Los resultados demostraron un efecto sinérgico de pronasa-CB sobre la eliminación de biopelículas de L. monocytogenes-E. coli, una mayor efectividad frente a L. monocytogenes y la necesidad de dosificar elevadas concentraciones de BAC para asegurar la ausencia de células viables adheridas y liberadas.

• Desarrollo de tolerancia a tratamientos combinados de pronasa-CB en biopelículas mixtas de L. monocytogenes-E. coli. Se evaluó el efecto de la frecuencia y duración de exposiciones subletales consecutivas de pronasa-CB sobre el desarrollo de tolerancia en biopelículas mixtas de L. monocytogenes-E. coli. Los resultados demostraron que únicamente cuando las exposiciones subletales se acompañan de un periodo de recuperación se produce el desarrollo de tolerancia a la aplicación de los tratamientos combinados pronasa-CB.

Listeria monocytogenes is considered one of the major foodborne pathogenic bacteria in Europe. In nature, it is found forming part of multispecies biofilms, resistance structures constituted by an extracellular matrix acting as a protective barrier against external agents, hindering their action and generating sublethal concentrations inside the biofilm. In industrial environments, biofilms are usually exposed to sublethal concentrations of biocides, due to the fact that the biofilm is located in inaccessible locations or because of inefficient application. This can favour the appearance of resistant and persistent bacteria in industrial plants, which lead to an excessive biocide deployment with a subsequent higher environmental impact. Is hence necessary, to propose more effective and efficient cleaning and disinfection systems, able to ensure pathogen control, generate less resistance while maintaining the main environmental impact standards. In the present dissertation, the design of a specific cleaning and disinfection system based on the combined application of enzymes and benzalkonium chloride (BAC) against L. monocytogenes mixed biofilms present in the food industry is proposed. The initial hypothesis is that the application of enzymes might produce the disruption of the biofilm matrix that acts as a barrier to antimicrobials, facilitating the subsequent effect of the disinfectant. The specificity is achieved based on the previous characterisation of the L. monocytogenes-carrying biofilms present in industry that permits the enzyme selection, the dose adjustment and the study of the possible tolerance development. The experimental work was development in the following stages: • Characterisation of the L. monocytogenes-carrying communities present in fish, meat and dairy industry. This allowed detecting the presence and subtypes of L. monocytogenes, to characterise the accompanying microbiota and to study the adhesion dynamics of L. monocytogenes isolates on stainless steel (SS) as well as the association capacity and biofilm formation in mixed culture with the accompanying species.

• Effectiveness of the enzyme-BAC combination to remove early-stage L. monocytogenes-carrying biofilms. The effects of different enzymes alone and combined with BAC against early-stage L. monocytogenes mixed biofilms grown on SS was assessed. Results obtained demonstrated the efficacy of the enzyme-BAC combined application to remove L. monocytogenes mixed biofilms and highlighted that this efficacy varies with the composition and age of the biofilm, pointing out the importance of designing strain-specific cleaning and disinfection strategies.

• Quantification of the effects of pronase-BAC combined application against L. monocytogenes-E. coli late-stage dual-species biofilms. The individual and combined effects on the occupied surface, and the number of viable adhered and released cells after the application of pronase and BAC against late-stage L. monocytogenes-E. coli dual-species biofilms were assessed. Results demonstrated a synergistic effect of pronase-BAC application against L. monocytogenes-E. coli dual-species biofilms, a higher efficacy against L. monocytogenes, and the need to use high BAC doses to ensure the absence of adhered and released viable cells.

• Tolerance development to pronase-BAC combined treatments in L. monocytogenes-E. coli mixed biofilms. The effects of the frequency and duration of consecutive sublethal exposures to pronase-BAC on the development of tolerance in L. monocytogenes-E. coli mixed biofilms was assessed. Results showed that only when sublethal exposures are alternated with recovery periods, a tolerance development to the application of pronase-BAC combined treatments takes place.