Supramolecular organisation and biological properties of tumor targeted, self-assembling protein nanoparticles

Abstract

Degut a la seva flexibilitat funcional i arquitectònica, l’ús de proteïnes recombinants formades per múltiples dominis representen una eina interesant pel desenvolupament de nanopartícules capaces de transportar fàrmacs de manera específica. Recentment, en el nostre grup, hem aplicat un nou sistema d’enginyeria pel desenvolupament de nanoparticles formades mitjançant l’oligomerització de proteïnes modulars. L’eficàcia selectiva i l’absència de toxicitat d’unes nanopartícules dirigides al càncer colorectal demostra la capacitat d’aquest enfoc biotecnològic. Un enfoc basat en l’ús de pèptids catiònics en els extrems terminal d’una proteïna modular que li confereix la capacitat d’interaccionar amb sí mateixa formant nanopartícules proteiques. Per tal d’explorar la flexibilitat d’aquest enfoc, hem desenvolupat dues nanopartícules proteiques, anomenades A5G27-GFP-H6 i FNI/II/V-GFP-H6, que reconeixen i internalitzen, de manera específica, cèl·lules que expressen el receptor CD44. Aquestes proteïnes modulars formen estructures anulars de 14 nm, estables en plasma capaces d’internalitzar a través d’endocitosis sense presentar toxicitat cel·lular. Aquestes nanopartícules específiques són una plataforma prometedora com a nanomedicines pel transport de fàrmacs o sondes pel diagnòstic i tractament d’afliccions relacionades amb CD44. Durant la producció recombinant microbiana, moltes proteïnes heteròlogues tendeixen a acumular-se en cossos d’inclusió. Tenint en compte la última descripció d’aquestes entitats, constitueixen una font de proteïna pràcticament pura. Tot i que s’han desenvolupat tècniques per l’obtenció de proteïna activa mitjançant l’ús de detergents solubilitzadors no desnaturalitzants de manera satisfactòria, és desconegut com aquests procediments afecten el procés d’oligomerització de nanopartícules proteiques. En aquesta tesi, hem analitzat quin impacte té, a nivell estructural i funcional, l’origen de la font proteica. Depenent de si les nanopartícules deriven de la fracció soluble o de la resolubilització dels cossos d’inclusió, s’obtenen diferents organitzacions supramoleculars amb comportaments funcionals diferenciats. Aquests resultats demostren la rellevància que té l’origen cel·lular del material quan parlem d’estructures proteiques complexes. Tot i que recentment s’ha demostrat que la bactèria hoste té una influencia directe en la estructura i el rendiment de les nanopartícules proteiques, es desconeix com els hi afecta l’ús de bactèries amb un perfil genètic diferent com soques deficients en xaperones o lliures de lipopolisacàrids. En aquesta tesi, s’ha investigat l’estructura de nanopartícules dirigides a CD44 o CXCR4 produïdes en diferents soques d’E.coli i com les característiques fisicoquímiques afecten la biointeracció d’aquestes nanopartícules. Els resultats demostres la robustesa dels patrons d’oligomerització d’aquestes nanopartícules dirigides a tumor i la influencia que té el perfil genètic microbià en la proporció de les diferents poblacions oligomèriques en el producte cru. Aquesta variabilitat, intrínseca de la bioproducció, tot i ser imprevisible o incontrolable, constitueix un ventall de nanomaterial. De manera exclusiva es pot seleccionar aquella població de nanopartícules amb les característiques funcionals i fisicoquímiques òptimes considerant l’aplicació per la qual s’han dissenyat.

Recombinant multidomain protein building-blocks have demonstrated to be an appealing biotechnological approach for the development of cell-targeted, nanoscale drug carriers on account of protein functional and architectonic versatility. The colorectal tumor targeting efficacy as well as non-toxicity of T22-empowered nanoparticles validates the potential of the de novo engineering approach developed in our research group. An approach based on end-terminal cationic peptides as pleiotropic tags in self-assembling protein building blocks. In an attempt to explore the flexibility of this approach, we have developed two protein-only nanoparticles that specifically bind CD44-receptor, namely A5G27-GFP-H6 and FNI/II/V-GFP-H6. These designed building-blocks promote the formation of ring-shaped structures which are approximately 14 nm in size, stable in plasma that can internalise cells through endocytosis in absence of cell toxicity. These targeted protein nanoparticles, together with the stability and biodistribution of other tested multifunctional self-assembling protein nanoparticles, are promising platforms for the transport of drugs or imaging agents as nanomedicines for breast cancer or other CD44-linked afflictions. Referring to microbial cell factories, many of the recombinant proteins are likely accumulated in IBs upon induction stress; however, considering non-classical structure description of these protein build-ups they represent an abundant and pure protein source. Although active protein has been obtained from IBs through mild solubilisation procedures, it is still unknown how the recovery of active protein from IBs affects the self-assembling process into protein nanoparticles. Thus, we have analyse the impact on nanoparticle structure and functionality considering the protein material source (nanoparticles from the soluble cell fraction or resolubilised from IBs) of the developed CD44-targeted protein vehicles. We have identified altered supramolecular organisation and consequently distinct in vitro and in vivo performance of cell-targeted protein nanoparticles depending on material’s origin. It is a particularly important aspect regarding recombinant production of smart and complex protein structures Albeit it has been recently known that the bacterial host directly influence the architecture and the performance of the produced protein nanoparticles, how the genetic background of E. coli strains deficient of chaperons or LPS-free affect these protein assemblies has not been addressed. In this thesis we have investigated the fine structure of CXCR4 and CD44 targeted nanoparticles produced in different E. coli strains and how their physicochemical characteristics affect the nanoparticles’ biointeractions. Results illustrate the robustness of self-assembling patterns among tumor-targeted GFP nanoparticles and also the influence of genetic background of the producing cells on shifting the distribution of oligomeric population in the pooled material. The intrinsic variability derived from the bioproduction, although being unpredictable or uncontrollable, offers a scope of nanoparticulated material from where optimal population can be selected considering their ultimate application