Metabolisme dels Esfingolípids. Noves metodologies i efecte sobre l´autofàgia

Abstract

Els esfingolípids són lípids complexes derivats de l’esfingosina que a més de servir de base estructural de les membranes cel·lulars, regulen múltiples vies de senyalització, com per exemple l’autofàgia. Entre tots els esfingolípids, són la ceramida (Cer), la dihidroceramida (dhCer) i l’esfingosina-1-fosfat (S1P) les molècules amb un paper més determinant en l’homeòstasi cel·lular. És per això que els enzims involucrats en la formació d’aquests esfingolípids són clau per la determinació del destí cel·lular. Entre aquests enzims destaca la dihidroceramida dessaturasa 1 (Des1), les ceramidases (CDases) i finalment l’esfingosina-1-fosfat liasa (S1PL).

Tot i que s’han descrits mètodes per determinar l’activitat CDasa i S1PL, la recerca de nous moduladors enzimàtics requereix tècniques de cribratge d’alt rendiment (HTS). Tenint en compte que actualment aquestes metodologies són escasses, el primer objectiu de la tesi va consistir en determinar la capacitat de les CDases alcalines per hidrolitzar els substrats fluorogènics RBM14. Es va determinar l’activitat enzimàtica en diferents models cel·lulars, on les diferents CDases alcalines estaven sobreexpressades o silenciades, mesurant la fluorescència del substrat RBM14 quan és hidrolitzat. En cèl·lules que sobreexpressaven l’ACER3 es va alliberar més fluorescència dels substrats en comparació amb les cèl·lules control. En canvi en cèl·lules on l’ACER2 o l’ACER1 estaven sobreexpressades no es va detectar activitat enzimàtica. Per tant, de totes les CDases alcalines, s’ha demostrat que només l’ACER3, i no l’ACER1 ni l’ACER2, pot hidrolitzar els substrats RBM14.

El substrat fluorogènic RBM13 permet analitzar l’activitat S1PL aplicant procediments HTS, però no es pot emprar en cèl·lules ja que no pot travessar la membrana plasmàtica. Amb l’objectiu de millorar la incorporació dins les cèl·lules dels substrats RBM13, i els seus anàlegs millorats RBM77 i RBM148, es va decidir encapsular els compostos en liposomes catiònics. Amb els substrats lliures, sense ser encapsulats, no s’observà activitat enzimàtica. No obstant, una vegada encapsulats es va detectar fluorescència i aquesta va resultar ser dependent de la concentració del substrat i, tal com s’esperava, era més elevada en les cèl·lules que sobreexpressaven la S1PL.

L’autofàgia és un procés en el que la cèl·lula degrada proteïnes i orgànuls en els autofagolisosomes. El propòsit és reciclar material cel·lular per mantenir el metabolisme actiu durant l’escassetat de nutrients o evitar l’acumulació de material danyat. L’últim objectiu de la tesi va consistir en estudiar la relació entre les dhCer i l’autofàgia, i la seva repercussió en la mort o en la supervivència cel·lular. Es va examinar la capacitat de diferents inhibidors de Des1 d’estimular l’autofàgia i el seu efecte en el destí cel·lular en dues línies de glioma humà, les T98G i les U87MG.

En primer lloc es va comprovar que el celecoxib (CCX), fenoxodiol (PXD), resveratrol (RV), γ-tocotrienol (γ-TE) i XM462 provocaven una acumulació de dhCer. Això era degut a la inhibició de l’enzim Des1 juntament amb l’estimulació de la via de biosíntesi de novo dels esfingolípids. En les mateixes condicions en les que es va analitzar l’esfingolipidoma, els compostos van induir autofàgia. No obstant, l’autofàgia va ser també activada en absència de dhCer, indicant l’existència d’un mecanisme d’inducció d’autofàgia per part dels compostos independent de dhCer. Quan es va inhibir l’autofàgia en aquestes cèl·lules, els compostos eren menys tòxics, suggerint que la via d’inducció d’autofàgia independent de dhCer és citotòxica. D’altra banda quan es va inhibir l’autofàgia en les cèl·lules amb nivells normals de dhCer, els compostos eren més tòxics demostrant que la via d’inducció d’autofàgia dependent de dhCer és un mecanisme de supervivència cel·lular. Els resultats suggereixen que els compostos indueixen l’autofàgia per ambdues vies dependent i independent de dhCer, i és l’equilibri entre elles el que influeix en el destí cel·lular.

Sphingolipids are molecules that, in addition to their structural function in cell membranes, regulate multiple signalling pathways and contribute to various cellular functions. Among the enzymes of sphingolipid metabolism, dihydroceramide desaturase 1 (Des1), ceramidases (CDases) and sphingosine-1-phosphate lyase (S1PL) play a decisive role in the cell fate.

Although several methods for CDase and S1PL activity determination have been described, most of them do not allow the application of HTS assays. The first objective of the thesis was to determine the ability of the alkaline CDases to hydrolyze the RBM14 fluorogenic substrates. Different cell models with the alkaline CDases overexpressed or silenced were used. It was shown that among all alkaline CDases, only ACER3, and not ACER1 or ACER2, could hydrolyse RBM14 substrates.

In order to improve the incorporation into the cells of the S1PL substrates RBM13 and their improved analogues RBM77 and RBM148, we decided to encapsulate the compounds into cationic liposomes. With the free substrates, no enzymatic activity was observed. However, once encapsulated, the probes were hydrolysed by S1PL and the resulting fluorescence was dependent on the substrate concentration and, as expected, it was higher in cells overexpressing S1PL.

The last objective of the thesis was to study the relationship between dihydroceramides (dhCer) and autophagy, and its repercussion on the cell fate of two glioblastoma cell lines, T98G and U87MG. First of all it was verified that celecoxib (CCX), phenoxodiol (PXD), resveratrol (RV), γ-tocotrienol (γ-TE) and XM462 induced autophagy concomitantly with dihydroceramide (dhCer) buildup due to stimulation of ceramide synthesis de novo and decreased Des1 activity. However, autophagy activation was also induced in the absence of dhCer accumulation, indicating the existence of a dhCer-independent autophagy induction mechanism. In this context, the compounds were less toxic, suggesting that this pathway is cytotoxic. On the other hand, when autophagy was inhibited in cells with normal dhCer levels, compounds were more toxic showing that this pathway is a mechanism of cell survival. We propose that Des1 inhibitors activate autophagy via both dhCer-dependent and independent pathways and the balance between the two pathways influences the final cell fate.