Estudi dels potencials mecanismes involucrats en la carcinogènesi de l’arsènic

Abstract

Arreu del món, milions de persones estan exposades a l’arsènic. Estudis epidemiològics mostren un clar augment en la incidència de diferents tipus de càncer en aquestes poblacions. No obstant, encara existeixen molts dubtes sobre els mecanismes a través dels quals els compostos d’arsènic generen els seus efectes. L'objectiu d'aquesta tesi és aprofundir en els mecanismes d’acció de l’arsènic, tractant de revelar nous coneixements. Diversos estudis suggereixen que les espècies reactives d'oxigen (ROS) generades durant el metabolisme de l’arsènic juguen un paper principal en la carcinogènesi. Per això, un dels nostres objectius, serà avaluar el comportament del dany oxidatiu, mitjançant la tècnica del cometa, i del dany genotòxic, a través del test de micronuclis, en el DNA durant el procés de transformació tumoral in vitro. També estudiarem l’expressió dels gens As3mt i Mth1, per PCR a temps real, així com les conseqüències epigenètiques de l’exposició crònica. En aquest context, es van utilitzar fibroblasts embrionaris de ratolí (MEF) prèviament transformats durant 30 setmanes d’exposició a arsenit. Els resultats mostren que, tant el dany oxidatiu com el genotòxic augmenten fins als voltants del punt de transformació, i després disminueixen dràsticament. Curiosament, l'expressió de l’As3mt segueix el mateix patró de comportament que el dany en el DNA, mentre que l’expressió de Mth1 augmenta després del punt de transformació, sent el responsable de la disminució del dany observat, i establint-se així com un biomarcador útil en la carcinogènesi associada a l’arsènic. A més, es va observar una hipometilació global del DNA durant totes les setmanes d’exposició. D'altra banda, s’ha vist que l’exposició crònica a l’arsènic interfereix amb el funcionament de les rutes de reparació BER i NER, possiblement a causa d’inhibir la funció de determinades proteïnes. En canvi, la interacció de l’arsènic amb altres rutes de reparació no s’ha estudiat mai. Per tant, un altre punt d'interès d'aquesta tesi, serà determinar si l’arsènic es capaç d’alterar la funció de la ruta FA/BRCA. Per això, es van exposar cèl·lules a baixes concentracions de dos compostos trivalents d’arsènic, l’ATO i el MMAIII, durant dos setmanes, i després es va avaluar la resposta cel·lular enfront a diferents agents inductors d’enllaços creuats en el DNA (ICLs). Els nostres resultats indiquen que, la preexposició als compostos d'arsènic sensibilitza les cèl·lules enfront d'agents inductors d’ICLs, augmenta l'acumulació de cèl·lules en fase G2/M, redueix la quantitat de proteïna FANCD2 activa i augmenta la freqüència de micronuclis. En global, aquests resultats indiquen que exposicions ambientalment rellevants d'arsènic interfereixen en la funció normal de la ruta FA/BRCA, presentant-se per primer cop com un nou mecanisme de co- i carcinogènesi. Aquestes dades són importants per a l'ús de l’arsènic en la teràpia contra el càncer. Com que l’arsènic es capaç de sensibilitzar les cèl·lules enfront agents inductors d’ICLs, es suggereix que una combinació d’ATO i un agent inductor d’ICLs, augmentaria la resposta i milloraria els resultats, reduint els efectes secundaris associats. Per provar aquesta hipòtesi, es van tractar tres línies cel·lulars de càncer de bufeta amb una combinació d'ATO i cisplatí, un fàrmac àmpliament utilitzat. Primer es va demostrar que la teràpia combinada, era capaç d’alterar la funció de la ruta FA/BRCA en les cèl·lules de bufeta, i després es van avaluar altres punts, com la toxicitat i característiques extrínseques del fenotip tumoral. Els nostres resultats mostren que, en tots els casos, la teràpia combinada disminueix significativament la viabilitat de les cèl·lules exposades, disminueix el nombre de colònies capaces de créixer en agar tou, la velocitat de migració, la secreció de MMP, i la capacitat d'invasió de cèl·lules. De manera que, es planteja aquesta estratègia com una nova teràpia contra el càncer de bufeta on s’utilitzen concentracions de cisplatí més baixes, prevenint els seus efectes secundaris tòxics i evitant la recurrència del càncer.

Inorganic arsenic is a widely spread environmental contaminant. Epidemiological data clearly show an increase in the incidence of cancer in human populations living in arsenic-rich areas, mainly of the skin, lung, bladder, liver, prostate and kidney cancers. However, the associated carcinogenic mechanisms remain incompletely characterized. Hence, the aim of this Thesis is to deeper in the mechanisms of arsenic-related effects, trying to disclose new insights. Several studies suggest that reactive oxygen species (ROS) generated during arsenic biotransformation play an important role in arsenic-related carcinogenesis. One of the goals of this Thesis is to assess the behavior of oxidative damage, by using the comet assay, and genotoxic DNA damage, by using the micronucleus assay, along the acquisition of the in vitro cancer phenotype. Expression changes of AS3MT and MTH1 genes were also evaluated by real time RT-PCR, as well as, epigenetic consequences. Thus, mouse embryonic fibroblast (MEF) cells previously transformed by 30 weeks of chronic arsenite exposure were monitored at different time-of-exposure intervals for the complete duration of the exposure. Results indicate that the oxidative and genotoxic damage of chronically exposed MEF cells increase up to the point of transformation, but drop drastically afterwards. Interestingly, As3mt expression follows the same pattern than the DNA damage, while Mth1 increases its expression after the point of transformation, rather being the responsible of the observed DNA damage decrease. In addition, a global DNA hymomethylation was observed during the complete duration of the exposure. On the other hand, chronic arsenic exposure interferences with NER and BER pathways are well documented, presumably due to the arsenic ability of inhibiting proteins, but interactions with other DNA repair pathways are poorly explored. So, another point of interest of this Thesis is to scope whether arsenic disrupts the normal function of FA/BRCA pathway. For this, cells were exposed for two weeks to subtoxic concentrations of two trivalent arsenic compounds, ATO and MMAIII, and after that the cellular response to different inducers of the studied pathway was evaluated and compared to one FA/BRCA-deficient cell line. Our results show that preexposure to the trivalent arsenic compounds sensitizes cells in front of crosslinking agents, increases accumulation of cells in G2/M phase, reduces the amount of activated FANCD2 protein and increases the micronuclei frequency. Altogether our data demonstrate for the first time that environmentally relevant arsenic exposures disrupt the normal function of the FA/BRCA pathway, displaying a novel mechanism of arsenic co- and carcinogenesis. Our data are certainly significant for the use of arsenicals in cancer therapy. As it sensitizes cells to crosslinking agents, we suggest that combination chemotherapy of ATO and a crosslinking agent would increase the response and improve outcomes by lowering the associated toxicity side effects. To prove this hypothesis, three different bladder cancer cell lines were treated with a combination of low concentrations of ATO and cisplatin, a well-known chemotherapeutic drug. After proving the altered FA/BRCA repair capacity of the bladder cancer cells treated with ATO and cisplatin, several endpoints like toxicity and extrinsic hallmarks of cancer phenotype were assessed. Our results show that combined treatments significantly decrease the viability of exposed cells in all cases. Also, we find that the ATO/cisplatin cotreatment decreases the number of colonies able to grow in soft-agar, the cell migration rate, the MMP secretion, and the cell invasion capacity. Overall a combination of ATO and cisplatin would synergistically improve the anticancer outcomes with the need of lower cisplatin doses, eventually preventing from its toxic side effects and common cancer recurrence.