Avaluació de l’eficiència de l’ús dels fluids orals en el diagnòstic del PRRSV

Abstract

En els darrers anys, l’ús dels fluids orals (FO) com a mostra diagnòstica en el control i monitoratge del Virus de la síndrome reproductiva i respiratòria porcina (PRRSV) s’ha estès en gran mesura per l’Amèrica del Nord i de manera més discreta per Europa. Tanmateix, no existeixen gaires estudis sobre els límits de detecció de la tècnica en el monitoratge de la malaltia en granges infectades amb el PRRSV1. Per aquesta raó l’objectiu de la present tesi va ser avaluar l’eficiència de l’ús dels fluids orals en el diagnòstic del PRRSV1, determinant els factors que influeixen en la seva eficàcia diagnòstica. L’objectiu del primer estudi va ser l’avaluació de l’excreció individual en FO del PRRSV1 al llarg del temps, en animals inoculats, infectats per contacte i infectats vacunats. Paral·lelament, es va valorar la sensibilitat en la detecció de l’excreció del virus en els FO per PCR quantitativa, prenent com a referència la virèmia. Els animals inoculats i infectats per contacte van mostrar un patró d’excreció en FO semblant, en canvi el patró dels animals vacunats va ser més inconstant. En els animals vacunats també es va produir una reducció significativa del període d’excreció (P<0.05). Els valors Kappa entre els FO i el sèrum van ser >0.68 en tots els casos. L’objectiu del segon estudi era identificar i valorar les pèrdues d’eficiència que es podrien donar durant el procés d’anàlisi de les mostres de FO per qRT-PCR: efecte de les diferents matrius per la recollida de les mostres, el temps i la temperatura fins a la seva anàlisi, les condicions de conservació, l’efecte de la centrifugació, de diferents mètodes d’extracció de l’RNA i dels reactius per la PCR. Es van utilitzar FO lliures de PRRSV infectats amb concentracions conegudes del virus. No es van trobar diferències entre les matrius de recol·lecció ni els mètodes de conservació dels FO. En canvi, es va observar una menor sensibilitat analítica (P<0.05) en les mostres mantingudes durant 72h a 4ᵒC. En les dilucions límit, la centrifugació a 15.000 g va produir un augment significatiu en la sensibilitat de les mostres (P<0.05). Els mètodes d’extracció amb majors eficiències van ser el TRIzol®, el MagMAX™ i el NuceoSpin®. En dilucions de FO iguals, el kit de qRT-PCR LSI VetMAX® va donar menors Cts que l’AgPath™. En el tercer estudi, a partir de la bibliografia existent i les dades obtingudes en els experiments anteriors, es va elaborar un càlcul de probabilitats per determinar els límits de la detecció del PRRSV1 en FO quan s’usa en granges amb baixes prevalences. Es van comparar diversos tipus de granges d’acord amb l’estructura de les maternitats, de les transicions i la mida del mostreig. Segons els resultats obtinguts, els factors determinants de la detecció del PRRSV van ser la incidència dels esdeveniments verticals, el nombre de truges en producció, la mida dels corrals de transició, així com el nombre de corrals analitzats. La qRT-PCR va ser capaç de detectar el virus en els FO en la majoria d’escenaris possibles, fins i tot quan es tenia un sol animal infectat en corrals de 50 o menys animals. En la majoria de casos, incidències de parts amb animals virèmics inferiors al 5% en granges de 1.000 o menys truges, feien que la presència d’animals infectats en els corrals de transició fos un fenomen rar, i la seva detecció depengués més del nombre de corrals mostrejats que de qualsevol altra circumstància. Com a conclusió, els resultats de la present tesi estableixen un protocol que maximitza la sensibilitat en la detecció del PRRSV1 en FO i en demostren la seva validesa en transicions amb baixes prevalences.

In recent years, the use of oral fluids (OF) for the diagnosis and monitoring of Porcine respiratory and reproductive syndrome virus (PRRSV) has increased popularity in North America while in Europe its use is still scarce. Few studies have been conducted on the performance of diagnostic techniques for PRRSV1 using OF. The general objective goal of the present thesis was to evaluate the efficiency of the use of OF in the diagnosis of PRRSV1, determining the factors influencing their diagnostic performance. The first study is aimed at evaluating at an individual level, shedding of PRRSV1 in OF over time of pigs inoculated experimentally and in naïve and vaccinated animals infected by contact with inoculated pigs. In addition, the agreement between virus shed in OF and viremia was also assessed. Inoculated and naïve pigs showed a similar pattern of shedding of PRRSV in OF while vaccinated showed a more variable and irregular pattern. The average period of shedding in OF was significantly shorter (P<0.05) in vaccinated animals compared to the others. Kappa values for the comparison of blood and OF were >0.68 in all cases. The purpose of the second study was to identify and assess the losses of efficiency during the process of analysis of OF samples by qRT-PCR: the effect of different matrices for collecting the samples, different times and temperatures until the analysis, conditions of storage, the effect of centrifugation and different PCR reagents and RNA extraction methods. OF collected from weaners of PRRSV-free commercial farms were spiked with known concentrations of PRRSV1. There were no differences between the results obtained with the different collection matrices or conservation methods. Regarding storage, a significant loss of analytic sensitivity (P<0.05) was observed when OF were stored for 72h at 4ᵒC. Centrifugation at 15,000 g increased significantly (P<0.05) the sensitivity for samples containing 100 TCID50/mL. The RNA extraction methods that resulted in the best efficiencies were TRIzol®, MagMAX™ and NucleoSpin®. At similar dilutions, the LSI VetMAX® produced less Ct for the detection of the virus in OF than AgPath™. In the third study, based on the existing literature and data obtained in previous experiments, we calculated the probability of detecting PRRSV1 when pen-based OF were used for monitoring by qRT-PCR in low prevalence farms. Different types of farms were compared according their farrowing and nursery structure, and the size of sampling. Regarding the results obtained, the most decisive factors influencing the detection of PRRSV were the incidence of vertical events, the size of the reproductive herd and the pens for weaners; and the number of pens examined. The qRT-PCR would be able to detect PRRSV in OF in most scenarios even when there was only one infected animal out of 50 penmates. The main factors which limited the detection of PRRSV were the proportion of viremic farrows and the distribution of infected animals from the farrowing units to the nurseries. In most cases, in farms with ≤1,000 sows and less than 5% of PRRSV1 incidence, the presence of infected animals in nursery pens were a rare event and the most important factor was the number of pens sampled. In conclusion, the results of the present thesis establish a protocol for optimising the sensitivity of PRRSV1 detection in OF samples. Taking into account these recommendations, OF are a good diagnostic tool for the detection of virus circulation in nurseries because PRRSV is detected even in the worst scenarios.