Sustainable carbohydrase production using organic wastes through solid-state fermentation: operational strategies and microbial communities assessment

Abstract

De acuerdo con la línea de investigación de fermentación en estado sólido (FES) que actualmente se desarrolla en el grupo de investigación de compostaje (GICOM) el objetivo principal de esta tesis es desarrollar un proceso sustentable y a una escala representativa para la producción de celulasas utilizando residuos orgánicos. Con el fin de lograr este objetivo se analizaron diferentes residuos orgánicos y su potencial para la producción de celulasas a escala de laboratorio. Además, se utilizó compost como inoculo mixto, con el objetivo de incorporar el matriz sólida microorganismos capaces de degradar material lignocelulósicos. Luego de la selección de los mejores substratos en reactores de 0.5 L, se llevó a cabo el escalamiento del proceso en reactores de 10 L and 50 L. Todos los experimentos fueron desarrollados en condiciones cercanas a adiabáticas utilizando reactores aislados térmicamente. Durante el desarrollo del proceso, se realizó la monitorización de la actividad biológica reflejada como la velocidad especifica de consumo de oxígeno (sVCO) y temperatura.

El principal desafío a superar cuando se trabaja con FES y residuos orgánicos son, por un lado, el desarrollo de un proceso en continuo y, por otro lado, que el proceso desarrollado sea reproducible y consistente. Ambas temáticas fueron abordadas durante el desarrollo de la tesis.

Un primer acercamiento a un proceso en continuo se desarrolló para la producción de amilasas utilizando fibra de soja y residuos de pan como substrato y Thermomyces sp como inoculo. Se evaluaron tres estrategias de operación en reactores secuenciales, retirando del reactor una parte del sólido fermentado en el momento de: máxima sVCO y máxima actividad de amilasas. En esta última se evaluó la reinoculación con y sin extracción enzimática. En todas las estrategias se obtuvo un incremento por sobre el 200%.

Debido al éxito de la operación en continuo para la producción de amilasas, se desarrolló un proceso similar para la producción de celulasas utilizando las condiciones operacionales desarrolladas a escala laboratorio. Inicialmente se consideró la incorporación de compost como inóculo (10%) y cascarilla de café como substrato (90%). Después de conseguir el máximo de actividad de celulasas, el sistema se continuó operando en ciclos, substrayendo una cantidad determinada de material y reemplazándolo por substrato fresco. Se trabajó con tasas de intercambio de 50% y 90%. Finalmente se pudo desarrollar exitosamente un proceso en continuo para la producción de celulasas, logrando producciones sostenidas en el tiempo entre 8-9 unidades de actividad por gramos de materia seca. Adicionalmente, se caracterizó el sólido fermentado obtenido al final de la fermentación con la finalidad de identificar las poblaciones microbianas presentes. En este sólido se identificaron una amplia gama de bacterias y hongos capaces de degradar material lignocelulósico, por lo que se catalogó como un inóculo especializado que podría ser utilizado con la finalidad de desarrollar un proceso reproducible; sin necesidad de la adición continua de nuevo inóculo. Finalmente, se evaluaron a escala piloto (50 L) la reproducibilidad y consistencia del proceso utilizando el inóculo especializado y cascarilla de café como substrato en triplicados. Adicionalmente, se analizaron las emisiones gaseosas generadas durante el proceso con la finalidad de determinar los posibles requerimientos de una unidad de tratamiento de gases. Los resultados obtenidos en estos experimentos mostraron que tanto la dinámica del proceso como la producción enzimática fueron consistentes y robustas. Además, el proceso puede ser catalogado como amigable con el medioambiente, debido a la valorización de residuos orgánicos, así como también debido a los bajos factores de emisión generados por el sistema.

According to the solid-state fermentation (SSF) research line of the composting research group GICOM, the main goal of this thesis is to develop a sustainable process for the production of carbohydrases using organic wastes in a representative scale. To achieve this goal, several organic wastes were screened on its potential to produce cellulase at laboratory scale. Also, compost was added as a complex mixture of biomass in order to provide cellulose-degrading microorganisms. After the selection of the two best substrates: orange peels and coffee husk using 0.5 L reactors, the scale up was assessed in 10 and 50 L reactors. All SSF were undertaken in near-adiabatic conditions using thermally isolated reactors with a continuous monitoring of the biological activity reflected as specific oxygen uptake rate (sOUR) and temperature.

The main challenges to overcome in SSF using organic wastes is on one hand the possibility to work in a continuous configuration and, on the other hand, the reproducibility of the proposed process. These two aspects were assessed in this thesis.

A first approach towards a continuous process was carried out for the production of amylase using bread waste and soy fiber as substrate and adding Thermomyces sp as inoculum. Three different strategies were developed in a sequential batch operation by removing part of the substrate in three diffeerent stages of the process: during maximum sOUR, maximum amylase activity and maximum amylase activity with a posterior enzymatic extraction. An increase of above 200% in amylase activity production was obtained in all the assessed strategies.

Due to the success of the amylase production in a continuous configuration, the next step was to use the operational conditions obtained at laboratory scale for cellulase production and develop a sequential batch operation in 4.5L reactors. An initial compost addition as inoculum was considered only at the beginning of the fermentation. After reaching the maximum cellulase production the system started working in cycles, removing one part of the substrate and replacing it for fresh substrate. Two substrate exchange ratios were evaluated: 90% and 50%. Using this configuration, a continuous process was carried out, with a continuous production of cellulase and valorization of organic wastes and eliminating the requirement for fresh inoculum in each cycle. The sequential batch operation resulted in the successful production of cellulase with sustained values around 8-9 filter paper units per grams of dry matter in both configurations. In addition. the microbial communities present at the end of this operation was characterized, identifying several cellulose, lignin and hemicellulose degraders. This fermented solid was described as a specialized inoculum able to colonize the solid matrix of the reactor and provides the opportunity to develop a reproducible process. Finally, the reproducibility and consistency of the process was assessed in triplicates in a 50 L reactor using the specialized inoculum and coffee husk as the substrate. In addition the gaseous emissions were measured in order to fully understand the process and to determine the requirement of a gas treatment unit. Results showed that the process in consistent and robust with minor emissions of pollutants.