Proteases from protein-rich waste: production by SSF, downstream, immobilisation onto nanoparticles and application on protein hydrolysis

Abstract

El trabajo realizado en esta tesis se enmarca dentro de las principales líneas de investigación del grupo de compostaje (GICOM), por una parte, en la valorización de residuos sólidos por medio de la fermentación en estado sólido (FES) para la obtención de productos de valor añadido en consoncia con el nuevo paradigma de considerar los residuos como materias primas y, en segundo lugar, en la utilización de nanomateriales para potenciar el uso de los productos obtenidos mediante FES. La primera parte se centra en el aprovechamiento de residuos sólidos para la producción de enzimas de interés, concretamente proteasas. Las enzimas se produjeron a partir de la FES de la mezcla de residuo de pelo vacuno procedente de la industria de curtidos y lodos procedentes del proceso de digestión anaerobia utilizado como cosubstrato e inóculo. Por una parte se ha demostrado la capacidad de producir proteasas y sus posibles aplicaciones en la propia industria, ya que se han obtenido buenos resultados en el proceso del depilado del cuero. Además, se ha establecido un esquema para el tratamiento posterior a la fermentación, incluida la reutilización de los residuos generados a lo largo del proceso de modo que se aproxime a un sistema de residuo cero. La segunda parte del trabajo consistió en una exploración preliminar para determinar cuáles son los soportes más eficientes para inmovilizar las proteasas producidas por FES de cara a su uso continuado y su mejor preservación. Se utilizaron proteasas obtenidas a partir de la FES de residuos ricos en nitrógeno, pelo vacuno utilizado en la primera parte del trabajo y residuo de soja de una industrial alimentaria. Se evaluó la aplicabilidad, reutilización, reproducibilidad y coste de los soportes para su uso en la inmovilización de dichas proteasas. La evaluación se efectuó con 10 materiales considerando su bio-compatibilidad con las proteasas: nanopartículas de oro (NpAu), perlas de quitosano (húmedas y secas), perlas de quitosano con nanopartículas de oro (Quitosan/Au), zeolitas funcionalizadas, resina aniónica A520, resina aniónica con nanopartículas de oro (A520/Au), nanopartículas de óxido de hierro (Fe3O4) y nanopartículas de óxido de titanio (TiO2). La eficiencia de la inmovilización se determinó a partir del rendimiento de inmovilización y la carga enzimática de cada soporte (U/mg). Las nanopartículas de óxido de hierro resultaron ser un soporte prometedor gracias a su bajo coste y a su fácil separación de forma magnética, aumentado así sus posibilidades de reutilización. En último lugar, tanto las proteasas obtenidas a partir de los residuos de pelo como las de residuo de soja se inmovilizaron para ser evaluadas en la hidrólisis de proteínas, cuya eficiencia se comparó con la de las enzimas libres en el medio. Se utilizaron substratos de diferente origen (animales y vegetales): caseína, albúmina de huevo y proteína de salvado de avena, observado un efecto diferente según el origen de la proteasa utilizada. Estos resultados se corroboraron con los aminoácidos liberados tras la hidrólisis de las proteínas. En términos globales, este estudio representa una investigación multidisciplinaria que abarca, por una parte, la gestión y valorización de residuos orgánicos mediante el proceso de fermentación en estado sólido, con la producción y recuperación del producto de interés, incluyendo la etapa de postratamiento y así como la aplicabilidad del producto. Además, la immbolización de las proteasas sobre nanopartículas de bajo coste se ha demostrado efectiva en la hidrólisis de proteinas tipo, consistuyendo una alternativa de bajo coste (tanto su producción como el soporte) a las técnicas actuales.

In line with the main research lines of Composting research group (GICOM), this thesis focuses on the valorisation of solid organic residues and the utilisation of nanomaterials. Thus the thesis mutually linked the studies by transforming the solid waste using solid state fermentation (SSF) into value-added products and the use of nanoparticles to enhance the use of products obtained from SSF. The first major part covers the valorisation of solid waste and transforms it into valuable product namely protease. The protease was produced through the fermentation of hair waste and anaerobically digested sludge (ADS) acting as co-substrate and inoculum. For industrial application, the protease produced from this work has shown a good result on dehairing of cowhides. This chapter not only demonstrated from the production of protease until application on industrial activity but also exhibited the downstream processing in SSF and reutilisation of the remaining residues after SSF which was a crucial thing to establish a zero discharge. The second major part consisted of a preliminary screening work intending to determine the most suitable support for immobilisation of proteases. Proteases produced from two different protein-rich solid wastes: hair waste and soy fibre residue. The work aimed to find the feasible, reusable, reproducible, and cost-effective supports or carrier to be exploited for protease immobilisation. There were 10 materials were assessed for their biocompatibility with the protein: gold nanoparticles (AuNps), chitosan beads (wet and dry), chitosan beads coupled with gold nanoparticles (chitosan/Au), functionalised zeolite particles, the anionic resin (A520), anionic resin coupled with gold nanoparticles (A520/Au), magnetic iron oxide (Fe3O4) nanoparticles (MNPs), titanium oxide nanoparticles (TiO2_A and TiO2_B). The immobilisation efficiency was monitored based on immobilisation yield (% IY) and enzyme loading per carrier (U/mg). Iron oxide nanoparticles were shown as a promising support thanks to its low-cost and easy separation by a magnetic force, thus increasing their possibilities of reuse. In the last part of the thesis, both of the proteases from hair waste and soy fibre residue were immobilised on the support and were tested for application in protein hydrolysis. The efficiency of immobilised enzymes was compared with the free enzymes during the protein hydrolysis. Not to mention, the use of the different type of proteases (animal and plant origin) also was assessed during the protein hydrolysis of different type of protein (casein, egg white albumin, and oat bran protein isolate), since different protease produce different effect towards certain substrates. The amino acids released after hydrolysis reaction were well balanced with the degree of hydrolysis according to each protein substrates. Overall, the study represented a multidisciplinary research field spanning waste management using solid state fermentation including the downstream processing and its application. In addition, the immobilisation of proteases on low-cost nanoparticles has been shown to be effective in the hydrolysis of proteins, being a low-cost alternative (both production and support) to actual techniques.