HIV virus-like particle production in cap cells

Abstract

Les virus-like particles (VLPs) derivades de l’HIV presenten un gran potencial com a vacunes de nova generació. La proteïna Gag s’ensambla de forma espontània a la membrana cel·lular, donant lloc a VLPs amb embolcall. Per a generar VLPs en suficient quantitat i amb la qualitat requerida per a estudis clínics, es necessiten processos de producció robustos. A més, la disponibilitat de mètodes analítics senzills i confiables és crítica per al desenvolupament, optimització i monitorització d’aquests processos. Les cèl·lules de mamífer són la plataforma preferida per a produir VLPs, ja que proporcionen l’ambient necessari per a la seva correcta formació i ensamblatge. En aquest treball, es va desenvolupar un procés de producció per a VLPs de Gag-GFP mitjançant la línia cel·lular CAP, que destaca per la seva novetat. El primer pas va ser el desenvolupament d’una tècnica de quantificació basada en fluorescència, per a poder-la utilitzar de forma rutinària en el desenvolupament del bioprocés. A més, el mètode es va validar d’acord a l’ICH. El mètode era específic per a Gag-GFP i les mesures de fluorescència correlacionaven amb les mesures d’ELISA de referència. El mètode era adequat ja que mostrava poca variabilitat, un rang de treball de 3 ordres de magnitud i un límit de detecció suficientment petit com per a poder quantificar mostres sense purificar. La producció de VLPs es va dur a terme mitjançant transfecció transitòria amb PEI a línia cel·lular CAP-T. El procés a petita escalar es va optimitzar de forma sistemàtica. Primer, algunes variables es van estudiar per separat per a establir les condicions inicials. La falta d’un medi de cultiu compatible amb el creixement cel·lular i la transfecció forçava la realització d’un recanvi de medi abans de la transfecció. La densitat cel·lular en el moment de la transfecció, i les concentracions de DNA i de PEI es van optimitzar mitjançant una metodologia de Disseny d’Experiments. El títol aconseguit va ser de 6×1010 VLP/mL, amb les característiques desitjades. A continuació, es va dur a terme l’escalat del procés de transfecció a bioreactor d’1L, centrat en dos aspectes principals: el creixement cel·lular amb un estat fisiològic òptim i evitar el recanvi de medi per centrifugació abans de la transfecció, ja que no és desitjable a escales grans. Les cèl·lules CAP-T es van cultivar en bioreactor controlant el pH amb bicarbonat de sodi i amb aeració superficial. El recanvi de medi es va evitar cultivant les cèl·lules en una combinació de medis (FreeStyleF17 + 1% de PEM) compatible amb el creixement cel·lular i la transfecció transitòria. Aquesta innovadora estratègia va permetre simplificar significativament la transfecció transitòria a gran escala, mentre que es van aconseguir un bon creixement cel·lular, bona eficiència de transfecció i una producció de VLPs d’alta qualitat comparable al sistema a petita escala. El següent pas va ser la generació d’una línia cel·lular per a produir de forma estable les VLPs. La metodologia que es va utilitzar va ser la limiting dilution. Es van analitzar ~80 clons per a seleccionar el més productiu. A més, es va millorar la productivitat del clon seleccionat mitjançant sorting de les cèl·lules amb major intensitat de GFP. El cultiu d’aquest clon en bioreactor en fedbatch va donar lloc a un títol de 2×109 VLP/mL. Finalment, es va utilitzar l’espectroscòpia dielèctrica per a monitoritzar in-line els dos processos de producció de VLPs, basats en expressió estable i transient. La mesura de la permitivitat va permetre monitoritzar la densitat cel·lular en temps real. A més, els paràmetres de la corba de dispersió β mostraven perfils específics que es relacionaven amb events crítics durant el bioprocés, com ara canvis metabòlics o mort cel·lular.

HIV-1 virus-like particles (VLPs) have great potential as new generation vaccines. Upon expression, the Gag polyprotein of HIV-1 assembles spontaneously in the vicinity of the plasma membrane giving rise to enveloped VLPs. Robust production processes are required to generate VLPs of sufficient quality and quantity for pre-clinical and clinical evaluation. In addition, the availability of simple, fast and reliable analytical tools is critical to develop, optimize and monitor such processes. Mammalian cells are the preferred platform to produce VLPs, since they provide the required environment for their correct formation and assembly. In this work, a production process for Gag-GFP VLPs was developed using the novel CAP cell line. The first step was the development of a simple and cost-effective fluorescence-based quantitation technique that could be used routinely for bioprocess development. In addition, the method was validated according to ICH guidelines. The method showed to be specific for Gag-GFP and the fluorescence signal correlated well with the measurements of a reference ELISA assay. Little variability compared to ELISA, linearity over a 3-log range and a sufficiently low limit of detection to quantify crude samples demonstrated the suitability of the technique. The CAP-T cell line was used to produce Gag-GFP VLPs by PEI-mediated transient transfection. A systematic optimization of the process at small scale was performed. First, some variables were studied separately to set the conditions. The lack of a culture medium that was compatible with suitable cell growth and PEI-mediated transient transfection, forced the performance of a medium replacement step prior to transfection. Then, the cell density at the time of transfection, and the DNA and PEI concentrations were optimized by means of a Design of Experiments approach. The final titer obtained was 6×1010 VLP/mL, with the desired quality attributes. The scale-up of the transient transfection protocol to 1L bioreactor followed, focusing in two main aspects: cell culture with optimal cell physiological conditions and avoiding the medium replacement step by centrifugation prior to transfection, which is not desirable at large-scales. CAP-T cells were cultured in bioreactor by addition of carbonate to control pH and surface aeration. Remarkably, the medium replacement step was avoided by culturing the cells in a combination of media (FreeStyleF17 + 1% of PEM) compatible with both cell growth and PEImediated transient transfection. This novel strategy significantly simplified large-scale transient transfection, while suitable cell growth, transfection efficiency and high quality VLP production comparable to small scale were achieved. The generation of a stable CAP cell line producing correctly assembled Gag-GFP VLPs was the next step. The methodology employed was the classic limiting dilution, which has the advantages of being straightforward and easily implementable at any cell culture lab. A screening of ~80 clones was performed to select the most productive one. Moreover, the specific productivity of the selected clone was further improved by sorting the most intense GFP expressing cells. The culture of this clone at bioreactor level in fed-batch mode was successful, obtaining a VLP titer of around 2×109 VLP/mL. Finally, dielectric spectroscopy was employed for the in-line monitoring of the two VLP production processes set in this work, based on transient and stable expression. The measurement of the permittivity during the culture allowed to monitor the cell density in real time. Moreover, specific profiles of the β-dispersion parameters were identified, and related to critical events in the bioprocess, such as metabolic shifts or cell death.