Nuevas moléculas asociadas al cáncer de ovario para la mejora de su diagnóstico y tratamiento

Abstract

El cáncer de ovario (CO) es el cáncer ginecológico más letal y la quinta causa de muerte por cáncer en mujeres del mundo occidental. Debido a la inespecificidad de los síntomas y a la falta de técnicas diagnósticas eficaces, el CO es detectado en el 85% de los casos en estadio avanzado, resultando en una tasa de supervivencia a 5 años del 28%. En contraste, la tasa aumenta hasta el 92% si se detecta en estadios iniciales. Por lo tanto, existe una necesidad clínica evidente de identificar nuevos biomarcadores de diagnóstico. Para ello, se propone el estudio de los exosomas del aspirado uterino (AU) – muestra poco invasiva de la cavidad uterina, próxima al ovario – como nueva fuente de biomarcadores asociados al CO. Los exosomas son vesículas extracelulares de 20-200 nm, portadoras de señales que representan las células de origen, por lo que enriquecen la muestra en moléculas con significancia fisiopatológica. Puesto que no existe un consenso en los métodos de purificación de exosomas, el primer objetivo era establecer las bases del aislamiento de exosomas a partir de AU. Para ello, se compararon tres procedimientos basados en la ultracentrifugación (Estándar – ultracentrifugación a 100.000g –, Filtración – descarta contaminantes de tamaño superior a 200 nm –, y Sacarosa – descarta contaminantes de densidad diferente a 1,13-1,19 g/mL). En el marco del descubrimiento de biomarcadores, el procedimiento Estándar resultó ser el más adecuado para aislar exosomas de AU: permitió obtener la mayor concentración de exosomas, la mayor expresión de marcadores exosomales (CD63, CD81, CD9) y la mayor reproducibilidad. Posteriormente, se optimizó el protocolo para la extracción del ARN exosomal. Tras evaluar el efecto de la sonicación y la ARNasa A en diferentes puntos del procedimiento, se determinó que la mejor estrategia era deplecionar el ARN externo a los exosomas con ARNasa A tras la ultracentrifugación, sin aplicar la sonicación. Mediante RT-qPCR se pudo detectar la expresión de miARNs y ARNms asociados a patologías del tracto genital femenino. En el marco del tratamiento del CO (cirugía citorreductora y quimioterapia basada en platino/taxano), aunque inicialmente el 80% de las pacientes de CO responden favorablemente, el 90% de ellas recaen. Dado que la diseminación metastásica del CO es la principal causa del fracaso del tratamiento, la identificación de moléculas clave en dicho proceso podría llevar al desarrollo de nuevas terapias dirigidas contra la diseminación. Por consiguiente, el segundo objetivo era identificar nuevas dianas terapéuticas para bloquear la metástasis del CO. Para ello, se realizó un microarray en el que se comparó la expresión génica de muestras pareadas de T y M de pacientes de CO. Se seleccionaron aquellos genes que se encontraban significativamente sobre-expresados en M vs T, y que además estaban asociados a supervivencia baja: FABP4, MMP11, INHBA, GREM1, MXRA5, PLVAP y PXDN. Posteriormente, se validó la sobre-expresión de estos genes en M vs T en una cohorte independiente de pacientes de CO mediante RT-qPCR. La expresión correlacionaba significativamente en las M, pero no en los T, indicando un mecanismo subyacente que debe de resultar en la activación concomitante de las correspondientes vías de señalización. Seguidamente, se analizó la expresión de los candidatos mediante inmunohistoquímica en muestras pareadas de T y M de otra cohorte independiente de pacientes de CO. FABP4 y MMP11 resultaron ser los candidatos más prometedores, pues se encontraban sobre-expresados en más del 50% de las muestras analizadas. Asimismo, se determinó que FABP4 y MMP11 eran detectables en el plasma de pacientes de CO, y su expresión era más elevada que en el plasma de pacientes control, lo cual sugiere su potencial en el diagnóstico del CO.

Ovarian cancer (OC) is the most lethal gynaecological malignancy and the fifth leading cause of cancer deaths in women in the Western world. Due to the lack of specificity and lack of effective diagnostic techniques, OC is detected in 85% of cases at advanced stages, resulting in a 5-year survival rate of 28%. In contrast, the rate increases to 92% if it is detected at early stages. Therefore, there is a clear clinical need to identify new biomarkers for improving OC diagnosis. We propose the study of the exosomes derived from the uterine aspirate (UA) – uterine cavity sample collected by minimally invasive methods, proximal to the ovary – as a new source of diagnostic biomarkers for OC. Exosomes are 20-200 nm extracellular vesicles that represent the cells of origin, thus enriching the sample in molecules with pathophysiological significance. Since there is no consensus on the exosomes isolation methods, the first objective was to establish the bases of the exosomes purification protocols derived from UAs. To that end, we compared three different procedures based on ultracentrifugation (Standard – 100,000g ultracentrifugation –, Filtration – removes structures greater than 200 nm –, and Sucrose – removes structures with a density different from 1.13 -1.19 g / mL). The Standard protocol was the best performing procedure to isolate exosomes from AU since it allowed obtaining the highest exosomes concentration, the highest expression of exosomal markers (CD63, CD81, CD9) and the highest reproducibility. We further optimized the selected procedure for exosomal RNA extraction and analysis. After evaluating the effect of sonication and RNase A at different points of the procedure, we determined that the best strategy to obtain RNA specifically contained within exosomes from UAs was the depletion of external RNA applying RNAse A after ultracentrifugation, without sonication. Moreover, we detected the expression of specific miRNAs and mRNAs associated to female genital tract pathologies by RT-qPCR. Regarding OC treatment (cytoreductive surgery and chemotherapy-platinum / taxane), although 80% of OC patients respond propitiously, 90% of them relapse. Since the metastatic dissemination of OC is the main cause of treatment failure, the identification of key molecules in this process could lead to the development of new therapies against OC dissemination. Hence, the second objective was to identify new potential therapeutic targets to block OC metastasis. To do this, a microarray was performed to compare the gene expression of paired samples of T and M derived from OC patients. We selected those genes that were significantly over-expressed in M vs T and were also associated to poor survival: FABP4, MMP11, INHBA, GREM1, MXRA5, PLVAP and PXDN. Subsequently, we validated by RT-qPCR the over-expression of these genes in M ​​vs T in a new cohort of OC patients. Interestingly, we detected a significant correlation of the genes’ expression in M, but not in T, suggesting a common underlying mechanism that results in a concomitant activation of the corresponding pathways during the metastatic process. The expression of the candidates was then analyzed by immunohistochemistry in paired samples of T and M from another cohort of OC patients. FABP4 and MMP11 were the most promising candidates since they were over-expressed in more than 50% of the cases. In addition, FABP4 and MMP11 were detectable in plasma derived from OC patients, and their expression was significantly higher than in control patients, suggesting their potential use in OC diagnosis.