Nuevo algoritmo molecular para la clasificación del glioblastoma: correlato con los perfiles de expresión génica

Abstract

En los últimos años, y gracias al empleo de plataformas de análisis masivo de datos, se ha descrito la existencia de varios subtipos transcriptómicos de glioblastoma (GB) que definen subgrupos de pacientes con diferente supervivencia y respuesta a la terapia. Entre los distintos modelos de clasificación publicados, uno de los más referenciados es el de Verhaak y col, que divide los GB en los subtipos proneural (PRN), neural (NEU), clásico (CLS) y mesenquimal (MES). Además de diferencias en la expresión génica, estos subtipos muestran diferentes alteraciones moleculares tales como mutaciones en determinados genes o alteraciones en el número de copias. Las tecnologías que emplean estos estudios son muy complejas y costosas y no constituyen, a día de hoy, una herramienta accesible para la clasificación de los pacientes con GB en la práctica clínica diaria. El presente trabajo nace con el objetivo de comprobar si la clasificación transcriptómica podría reproducirse, de una manera más simple y económica, mediante el empleo combinado de algunas de las técnicas disponibles en los departamentos de anatomía patológica. Para ello hemos analizado, en una serie de 64 casos de GB, la expresión inmunohistoquímica (IHQ) de una serie de 11 marcadores (IDH1-R132H, p53, PTEN, CD44, Olig2, p16, D2-40, PDGFRA, vimentina-VIM, proteína glíal fibrilar ácida-PGFA y sinaptofisina-SINA), así como la amplificación de EGFR y PDGFRA mediante FISH y la existencia de la forma mutada EGFRvIII mediante RT-PCR. Con los datos obtenidos de estos análisis, hemos ensayado dos aproximaciones de clasificación. Por un lado, hemos aplicado una metodología de consensus clustering que nos ha permitido identificar tres subgrupos de GB (A, B y C) que remedan los subtipos PRN, CLS y MES de Verhaak, respectivamente. Por otro lado, hemos desarrollado un algoritmo de clasificación tipo “árbol de decisión” basado en el análisis secuencial de las mutaciones de IDH, la forma EGFRvIII, la amplificación de PDGFRA, la expresión IHQ de p53 y p16, la amplificación de EGFR y la expresión IHQ de D2-40 y CD44. Este “árbol de decisión” nos ha permitido distinguir tres subgrupos de GB (GB-P, GB-C y GB-M) que también remedan los subtipos PRN, CLS y MES, respectivamente. Los subgrupos GB-P, GB-C y GB-M presentan diferencias estadísticamente significativas en términos de supervivencia, de manera que los pacientes con GB subgrupo GB-C (el que remeda el subtipo CLS de Verhaak) tienen una supervivencia superior a la de los otros subgrupos. Además, la pertenencia al subgrupo GB-C constituye un factor de buen pronóstico, independientemente del tipo de cirugía, la edad y el índice de Karnofsky. Existe una asociación estadísticamente significativa entre los subgrupos de GB generados por nuestros dos modelos (el modelo de consensus clustering y el modelo de clasificación tipo “árbol de decisión”). A diferencia de las dificultades técnicas del modelo de consensus clustering, el algoritmo de clasificación tipo “árbol de decisión” constituiría una herramienta suficientemente precisa y de fácil implementación en la práctica diaria para la clasificación de los GB. Por último, en nuestras manos, la inmunorreactividad para sinaptofisina no constituye un dato suficientemente fiable como para considerarla un marcador del subtipo NEU de GB, el cual no creemos que exista en realidad.

The use of high-throughput screening platforms have revealed the existence of several transcriptomic subtypes of glioblastoma (GB) that define patients’ subgroups with different survival and response to therapy. One of the most referenced published models is that of Verhaak et al, which divides GB into the proneural (PRN), neural (NEU), classic (CLS), and mesenchymal (MES) subtypes. In addition to different gene expression pattern, these subtypes show different gene mutations and copy number variations, among others. The technologies used in these studies are very complex and expensive and, therefore, are not practical tools for routine GB classification. The objective of the present work was to reproduce this transcriptomic classification in a simpler and more economic manner by using techniques that are widely available in pathology departments. In a series of 64 GB cases we assessed immunohistochemical (IHC) expression of 11 markers (IDH1-R132H, p53, PTEN, CD44, Olig2, p16, D2-40, PDGFRA, vimentin-VIM, glial fibrillary acidic protein-GFAP, and synaptophysin-SYN), as well as EGFR and PDGFRA amplification by FISH and EGFRvIII occurrence by RT-PCR. With the data obtained we have tested two different classification approaches. On the one hand, we have applied a consensus clustering methodology that has allowed us to identify three GB subgroups (A, B, and C) that mimic PRN, CLS, and MES Verhaak subtypes, respectively. On the other hand, we have developed a "decision tree" classification algorithm based on the sequential analysis of IDH mutations, EGFRvIII occurrence, PDGFRA amplification, p53 and p16 IHC expression, EGFR amplification, and D2-40 and CD44 IHC expression. The “decision tree” approach allowed us to distinguish three GB subgroups (GB-P, GB-C, and GB-M) which also mimic the PRN, CLS, and MES Verhaak subtypes, respectively. The GB-P, GB-C, and GB-M subgroups show statistically significant differences in overall survival. Specifically, patients with GB subgroup GB-C (which mimics the CLS Verhaak subtype) have longer survival than patients in the other subgroups. In addition, belonging to the GB-C subgroup is a good prognostic factor, independently of the type of surgery, age, and Karnofsky index. There is a statistically significant association between the GB subgroups generated by our two models (the consensus clustering model and the “decision tree” type model). In contrast to the consensus clustering model technical difficulties, the "decision tree" classification algorithm would be a sufficiently precise and easily implemented tool for routine GB classification. Finally, in our hands, synaptophysin immunoreactivity is not sufficiently reliable to be considered as a marker of the NEU subtype of GB, a subtype whose existence we doubt.