Estudi dels exosomes com a mecanisme de comunicació intercel·lular en patologies pancreàtiques

Abstract

La pancreatitis aguda és un procés inflamatori del pàncrees desencadenat per una activació inapropiada dels enzims pancreàtics. En la seva variant més severa, la malaltia progressa acompanyada d’afectacions no només a nivell local sino també sistèmic, essent la síndrome de resposta inflamatòria sistèmica (SIRS) i el dany pulmonar que se’n deriva una de les afectacions més primerenques i la principal causa de mortalitat dels pacients. Diferents estudis han identificat l’increment en l’expressió i secreció de múltiples mediadors inflamatoris, generats tant a nivell local com sistèmic. No obstant, el mecanisme patogènic de la malaltia encara es desconeix, de manera que en les fases inicials de la malaltia no és possible predir si un pacient desenvoluparà una variant lleu o severa de pancreatitis. A llarg dels últims anys, però, el descobriment dels exosomes ha revolucionat el camp de la comunicació intercel·lular. Aquestes vesícules extracel·lulars són capaces de transferir proteïnes, miRNAs i mRNAs de manera encapsulada, tot protegint-los del medi extracel·lular i transportant-los fins a òrgans i indrets del cos allunyats del seu focus de síntesi.

En aquesta tesi, utilitzant un model experimental de pancreatitis aguda induïda per taurocolat sòdic en rata, hem avaluat el paper dels exosomes en la propagació de la resposta inflamatòria sistèmica.

Els resultats obtinguts indiquen que posteriorment a la inducció de la malaltia hi ha un increment de la concentració d’exosomes circulants, els quals presenten un perfil proteic diferent dels exosomes circulants que hi ha en condicions control. Mitjançant experiments de marcatge i seguiment d’aquestes vesícules hem determinat que els exosomes circulants són capaços de creuar la barrera alveolocapil·lar i d’arribar fins l’espai aveolar, on són captats pels macròfags pulmonars residents. A més, en experiments in vitro es demostra com els exosomes secretats en condicions inflamatòries activen i polaritzen els macròfags cap a un fenotip de tipus proinflamatori. L’anàlisi proteòmic dels exosomes circulants mostra com, durant la pancreatitis aguda severa, aquestes vesícules presenten una gran quantitat de proteïnes sintetitzades majoritàriament pel teixit hepàtic, suggerint que el fetge podria estar secretant nous exosomes i alliberant-los al torrent sanguini en el transcurs de la malaltia. Aquesta hipòtesi va ser reforçada amb nous experiments de marcatge i seguiment dels exosomes, gràcies als quals es va observar com els exosomes generats a la cavitat peritoneal durant la pancreatitis aguda severa són filtrats i retinguts pel teixit hepàtic. En conjunt, els resultats obtinguts reforcen la idea que el fetge tindria un paper central durant la pancreatits aguda i que cal tenir-lo en compte per comprendre quin mecanisme regula l’extensió de la resposta inflamatòria en el transcurs de la malaltia.

En tot aquest procés, a més, la lectina REG3-beta podria tenir un paper destacat. Aquesta proteïna d’estrès és una de les més sintetitzades pel pàncrees durant la pancreatitis aguda, la concentració de la qual pot arribar a augmentar fins a 100 vegades durant la fase aguda de la malaltia. La seva funció específica, però, a dia d’avui encara no s’ha descrit ben bé, tot i que se li han atribuït certes propietats antiinflamatòries, mitogèniques i d’opsonització de bacteris. En aquesta tesi es demostra com REG3-beta és capaç d’unir-se a la membrana dels exosomes circulants. A més, hem caracteritzat com aquesta unió depèn del seu domini lectina, i que comporta un bloqueig de la captació de les vesícules per part de les seves cèl·lules diana, impedint que aquestes alliberin els seus mediadors i duguin a terme la seva funció.

Severe acute pancreatitis is an inflammatory disease of the pancreas which progresses accompanied by local and systemic alterations, being lung damage and SIRS the leading causes of death. Despite multiple inflammatory mediators have been detected and described, the pathogenic mechanism of the disease is still unknown. However, over the last few years the discovery of exosomes has revolutionized the field of intercellular communication, since they are able to transfer mediators such as proteins, miRNAs and mRNAs to distant organs.

In this work, using an experimental model of taurocholate-induced acute pancreatitis in rats, we evaluated the role of exosomes in the extent of the systemic inflammatory response.

Our results indicate that during acute pancreatitis, there is an increase in the concentration of circulating exosomes. By fluorescent exosome tracking in vivo experiments we demonstrate that circulating exosomes are able to cross the alveolocapillary barrier, be phagocyted by alveolar macrophages and polarize them to a proinflammatory phenotype in vitro. The proteomic analysis of circulating exosomes showed that, during acute pancreatitis, exosomes present a large number of proteins synthesized mainly by the hepatic tissue, suggesting that the liver is secreting new exosomes and releasing them into the bloodstream during the course of the disease. This hypothesis was reinforced with new tracking experiments, where we observed that that exosomes generated in the peritoneal cavity during severe acute pancreatitis are filtered and retained by the liver tissue. Overall, these results reveal that the liver would play a central role during severe acute pancreatitis and that it should be taken into account to understand which mechanism regulates the extent of the inflammatory response.

The lectine REG3-beta could also play a prominent role in all this process. REG3-beta is the main protein synthesised by the pancreas during acute pancreatitis, the concentration of which can increase up to 100 times. Its specific function has not yet been described, although certain anti-inflammatory, mitogenic and opsonising properties have been attributed to it. In this thesis we demonstrate that REG3-beta binds to the membrane of circulating exosomes and that this interaction depends on its lectin domain. Consequently, this interaction blocks the exosome capture by target cells, preventing them from releasing their mediators and blocking their function.