Autofàgia i funció termogènica en el teixit adipós marró

Abstract

El teixit adipós marró (TAM) està format principalment per adipòcits marrons, la funció principal dels quals és el manteniment de la temperatura corporal de l’organisme a través de la termogènesi adaptativa. La capacitat termogènica de TAM ve donada per l’expressió de la proteïna desacobladora 1 (UCP1), una proteïna mitocondrial capaç de desacoblar la cadena respiratòria de la fosforilació oxidativa, generant calor enlloc d’ATP. Els treballs realitzats en la present tesi doctoral han estat orientats en l’estudi de la implicació de l’autofàgia en els processos adaptatius relacionats amb la funció termogènica que tenen lloc en el TAM. En el moment d’iniciar aquesta tesis existien pocs estudis sobre el paper de l’autofàgia en la biologia del TAM, ja que els estudis publicats en aquell moment principalment havien centrat l’atenció en el paper de l’autofàgia en el teixit adipós blanc. Vam hipotetitzar que l’autofàgia podria ser un procés important per a la funció termogènica en el TAM.

Entre els processos autofàgics, la degradació de mitocondris (mitofàgia) és un mecanisme de control de qualitat destinat al manteniment d’una xarxa mitocondrial en bones condicions. La mitofàgia és d’especial rellevància en cèl·lules amb alta capacitat oxidativa, com les cèl·lules musculars o les neurones. En canvi, a l’inici d’aquesta tesi el paper de la mitofàgia en el TAM, un dels teixits amb més capacitat oxidativa, no havia estat descrit. En aquest projecte es va identificar Parkin, una de les principals proteïnes relacionades amb la mitofàgia, com a un nou factor implicat en el control de la capacitat termogènica del TAM.

L’anàlisi de la regulació de l’autofàgia durant l’activació termogènica utilitzant models in vivo (exposició al fred ) i in vitro (cultius primaris d’adipòcits marrons) ens va permetre determinar que l’autofàgia és reprimida en associació amb l’activació de la termogènesi en el TAM. A més a més, en condicions basals, els adipòcits marrons mostren signes d’activitat lipofàgica, la qual es veu suprimida per l’estímul termogènic. Aquest efecte és reproduïble en adipòcits marrons per l’acció de la noradrenalina, la qual actua mitjançant l’cAMP, principalment a través de la via de la proteïna cinasa A. La inhibició de l’autofàgia en adipòcits marrons promou un increment en els nivells d’expressió de la proteïna UCP1, i un increment en la respiració desacoblada.

Un dels principals mecanismes per induir la mitofàgia és el reclutament de la proteïna Parkin als mitocondris danyats. La translocació de Parkin als mitocondris és mitjançada per la cinasa putativa induïda per PTEN 1 (PINK1), que actua com a sensor de dany mitocondrial. En aquest estudi descrivim que l’expressió de Parkin es veu fortament reprimida en el TAM de ratolins durant l’activació termogènica, mentre que PINK1 s’estabilitza als mitocondris. D’aquesta manera, la repressió de Parkin podria actuar de mecanisme regulador per tal de prevenir la degradació de mitocondris degut a la despolarització que es troba intrínsecament associada a l’activació termogènica. D’acord a la reciprocitat existent entre els nivells baixos de Parkin i l’activitat del TAM, els ratolins genèticament modificats per la falta d’expressió de Parkin presenten una elevada activitat termogènica en el TAM i són resistent a l’obesitat. Utilitzant adipòcits marrons en cultiu, vam trobar que la repressió de Parkin depèn principalment de mecanismes dependents de senyalització per àcids grassos. A més a més, el sistema PINK1-Parkin es troba activat durant la desaclimatació al fred, una situació en la qual el TAM s’inactiva i que alhora implica la pèrdua massiva de proteïna mitocondrial al teixit.

En resum, els resultats d’aquesta tesi ens han permès determinar que l’autofàgia i, especialment, la mitofàgia, actuen com a reguladors negatius de l’activitat termogènica del TAM.

Brown adipose tissue (BAT) is the main site of non-shivering thermogenesis, a mechanism of heat production that enables the organism to adapt to a cold environment. Brown adipocytes possess large amounts of mitochondria with a high oxidative capacity due to the expression of uncoupling protein 1 (UCP1). UPC1 uncouples the respiratory chain from oxidative phosphorylation yielding a high oxidation rate. Moreover, energy expenditure derived from BAT thermogenic activity provides a protective mechanism against obesity. Autophagy is a process that contributes to the maintenance of cellular homeostasis by degrading damaged or no longer needed organelles and cytoplasmic substrates into lysosomes. At the beginning of this thesis the role of autophagy in the adaptation of BAT to thermogenic activation had not been determined. We analyzed the effects of thermogenic activation in autophagy using in vivo and in vitro models. We found that autophagy is repressed in association with cold-induced thermogenic activation of BAT in mice. This effect was mimicked by NE action in brown adipocytes, acting mainly through a cAMP-dependent protein kinase A pathway. Moreover, we described the presence of active lipophagy in brown adipocytes under basal conditions, which is suppressed by the thermogenic stimulus. Reciprocally, inhibition of autophagy in brown adipocytes leads to an increase in UCP1 protein and uncoupled respiration. We also reported that Parkin, a protein implicated in the selective degradation of mitochondria (mitophagy), was repressed during BAT thermogenic activation, a transcriptional mechanism controlled by free fatty acids related pathways. Parkin is activated by PINK1, a protein that is stabilized in the outer membrane of damaged mitochondrial. We report that PINK1 is stabilized during thermogenic activation, probably in response to UCP1-mediated mitochondrial depolarization. Our data support the possibility that Parkin downregulation may be a compensatory mechanism to prevent PINK1-induced mitophagy. Otherwise, the PINK1-Parkin system is induced during cold-deacclimation, a situation of BAT inactivation. In accordance with the reciprocal association between low Parkin levels and BAT activity, mice lacking Parkin had an enhanced thermogenic activity and were resistant to diet-induced insulin resistance and obesity. In conclusion, autophagy and especially mitophagy are processes associated negatively with BAT thermogenic activation.

El tejido adiposo marrón (TAM) está formado principalmente por adipocitos marrones, la función principal de los cuales es el mantenimiento de la temperatura corporal del organismo a través de la termogénesis adaptativa. La capacidad termogénica de TAM viene dada por la expresión de la proteína desacopladora 1 (UCP1), una proteína mitocondrial capaz de desacoplar la cadena respiratoria de la fosforilación oxidativa, generando calor en vez de ATP. Los trabajos realizados en la presente tesis doctoral han sido orientados en el estudio de la implicación de la autofagia en los procesos adaptativos relacionados con la función termogénica en el TAM. En el momento de iniciar esta tesis existían pocos estudios sobre el papel de la autofagia en la biología del TAM, ya que los estudios publicados en ese momento principalmente habían centrado la atención en el papel de la autofagia en el tejido adiposo blanco. Nuestra hipótesis fue que la autofagia podría ser un proceso importante para la función termogénica en el TAM.

Entre los procesos autofágica, la degradación de mitocondrias (mitofagia) es un mecanismo de control de calidad destinado al mantenimiento de una red mitocondrial en buenas condiciones. La mitofágia es de especial relevancia en células con alta capacidad oxidativa, como las células musculares o las neuronas. En cambio, al inicio de esta tesis el papel de la mitofágia en el TAM, uno de los tejidos con mayor capacidad oxidativa, no había sido descrito. En este proyecto se identificó Parkin, una de las principales proteínas relacionadas con la mitofàgia, como un nuevo factor implicado en el control de la capacidad termogénica del TAM.

El análisis de la regulación de la autofagia durante la activación termogénica utilizando modelos in vivo (exposición al frío) e in vitro (cultivos primarios de adipocitos marrones) nos permitió determinar que la autofagia es reprimida en asociación con la activación de la termogénesis. Además, en condiciones basales, los adipocitos marrones muestran signos de actividad lipofágica, viéndose esta suprimida por el estímulo termogénico. Este efecto es reproducible en adipocitos marrones por la acción de la noradrenalina, la cual actúa mediante la cAMP, principalmente a través de la vía de la proteína quinasa A. La inhibición de la autofagia en adipocitos marrones promueve un incremento en los niveles de expresión de la proteína UCP1, y un incremento en la respiración desacoplada.

Uno de los principales mecanismos para inducir la mitofágia es el reclutamiento de la proteína Parkin en las mitocondrias dañados. La translocación de Parkin en las mitocondrias es mediada por la quinasa putativa inducida por PTEN 1 (PINK1), que actúa como sensor de daño mitocondrial. En este estudio describimos que la expresión de Parkin se ve fuertemente reprimida en el TAM de ratones durante la activación termogénica, mientras que PINK1 se ve estabilizada en las mitocondrias. De este modo, la represión de Parkin podría actuar de mecanismo regulador para prevenir la degradación de mitocondrias debido a la despolarización que se encuentra intrínsecamente asociada a la activación termogénica. De acuerdo a la reciprocidad existente entre los niveles bajos de Parkin y la actividad del TAM, los ratones genéticamente modificados por la falta de expresión de Parkin (Parkin-KO) presentan una elevada actividad termogénica en el TAM y son resistentes a la obesidad. Utilizando adipocitos marrones en cultivo, describimos que la represión de Parkin depende principalmente de mecanismos dependientes de señalización por ácidos grasos. Por otro lado, el sistema PINK1-Parkin se encuentra activado durante la desaclimatación al frío, una situación de inactivación del TAM que implica la pérdida masiva de proteína mitocondrial.

En resumen, los resultados de esta tesis nos han permitido determinar que la autofagia y, especialmente, la mitofàgia, actúan como reguladores negativos de la actividad termogénica del TAM.