Diagnòstic microbiològic de la tuberculosi i altres micobacteriosis a l’Hospital de la Santa Creu i Sant Pau: 1995-2007

Abstract

Els micobacteris, especialment les espècies del complex tuberculosi, són responsables de nombroses infeccions en humans. L'OMS ha declarat la tuberculosi (TB) com una emergència global, cada any moren aproximadament 3 milions de persones de TB i es desenvolupen al voltant de 9 milions de nous casos. Durant alguns anys es va creure que es podria eradicar la TB als països desenvolupats. No obstant això, la incidència de la TB en aquests països no ha seguit la línia descendent que s’havia projectat. Tot i que el 80% de la TB està concentrada en 22 països, la reemergència al primer món ha estat influènciada pel gran moviment migratori des de països amb alta incidència de TB (alhora amb greus problemes de multiresistencia); l’existència de borses de pobresa al món industrialitzati el desmantellament d’alguns programes de control de la TB. Per al control de la TB és necessari el diagnòstic precoç a fi d’interrompre la cadena de transmissió. Els mètodes tradicionals de diagnòstic microbiològic no són eficients donada la seva lentitud. En els últims 20 anys s’han desenvolupat nous mètodes d’aïllament, identificació, estudis de sensibilitat i tipificació tant per a M. tuberculosi com per a la resta de micobacteris. Encara que amb menor importància en l’àmbit de salut pública que M. tuberculosi, la freqüència d'aïllament de micobacterias no tuberculosas (MNT) va augmentant, i al mateix temps es van descrivint noves espècies susceptibles de produir patologia en humans. L'any 1975 el gènere Mycobacterium comprenia al voltant de 30 espècies, actualment se n'han descrit al voltant de 150. Per orientar el tractament dels diferents micobacteris és necessari arribar a la identificació al nivell d'espècie fins i tot dins del complex tuberculosi. Els estudis de sensibilitat en M. tuberculosi són particularment importants tant per al monitoratge de les taxes de resistència inicial en una comunitat, que influiran en els tractaments empírics dels casos d'aquesta comunitat, com per a la detecció de soques resistents en pacients amb factors de risc. Els estudis de sensibilitat en les MNT es limiten a poques espècies, M avium complex, M kansasii i micobacteris de creixement ràpid no pigmentats amb significació clínica. Per tot això, el laboratori de micobacteriologia clínica juga un paper important tant en atenció sanitària com en l’àmbit de la salut pública. S’han desenvolupat noves tècniques i per tal de donar resultats adequats i amb el mínim de temps possible. Tradicionalment s’han utilitzat tècniques fenotípiques per a la identificació i estudis de sensibilitat, actualment estan veient-se complementades per les tècniques basades en la biologia molecular, fins i tot aplicables directament en la mostra clínica. Els objectius principals d’aquesta tesi han estat l’avaluació dels mètodes de diagnòstic del laboratori de micobacteris ( examen directe, amplificació d’àcidsnucleïcs, aïllament per cultiu i identificació) i el seguiment de les resistències als antituberculosos en casos nous i pacients amb tractament previ. Com a objectius secundaris han estat l’avaluació de dos sistemes no radiomètrics (MB/BacT ALERT® i BACTEC MGIT 960®) per a l’estudi de la sensibilitat als antituberculosos de primera línia, la caracterització molecular dels mecanismes de resistència als fàrmacs de primera línia i la descripció dels diferents llinatges de les soques de M. tuberculosis resistents aïllades a l'Hospital de la Santa Creu i Sant Pau. Al llarg del període estudiat s’ha observat un augment de l’aïllament de MNT, coincidint amb la pandèmia de la SIDA, així com una disminució a partir de la introducció del tractament combinat d’alta eficàcia. També s’ha observat un descens global en els aïllaments de M. tuberculosi, a causa de la disminució en pacients autòctons, encara que s’observa un increment de pacients immigrants. La sensibilitat de la bacil·loscòpia en el diagnòstic de la tuberculosi respiratòria ha estat del 52.2%, sent l’esput la mostra més sensible (64,4%). En la tuberculosi extrarespiratòria la sensibilitat de la bacil·loscòpia ha estat del 23,7%, sent les mostres osteoarticulars les mésfreqüentment positives (35,7%). L’especificitat ha estat del 99,9% amb un VPP del 99,4%. Globalment s’ha observat una major capacitat d’aïllament dels mitjans de cultiu líquid. L’efecte inòcul és més significatiu en aquelles mostres amb la bacil.loscòpia negativa, el que corrobora la importància de la utilització dels dos tipus de medi de cultiu en l’aïllament. L’especificitat de l'AMTD per a la detecció d’àcidsnucleïcs M. tuberculosi complex ha estat bona (99.8%). La sensibilitat en mostres bacil·loscòpia positiva fou del 94.2%, disminuint considerablement en mostres bacil·loscòpia negativa (especialment en la tuberculosi extrarespiratoria). El percentatge de resistència global en casos nous ha estat del 7,9%, significativament més alta en pacients immigrants (16,7%) que en pacients autòctons (5,7%). La resistència global en pacients amb tractament previ fou del 15.1%, significativament més alta en pacients immigrants (46,2%) respecte als pacients autòctons (5%). La multiresistència només es va trobar en pacients immigrants. Els sistemes MB/BacT ALERT i BACTEC MIGIT 960 són una bona alternativa no radiométrica al sistema BACTEC 460 per a l’estudi de sensibilitat als fàrmacs de primera línia. Quant als fàrmacs de segona línia totes les soques amb resistència a l'ethionamida presentaven resistència creuada amb la isoniazida, sent aquesta en el 75% resistència de baix nivell. El 75% de les soques resistents a la RIF presentaven resistència creuada amb la rifabutina. No s'han trobat resistències a altres fàrmacs de segona línia. La resistència a la INH s'ha degut en el 39,3% dels casos a alteracions en el codó 315 del gen katG i en el 32,1% a la regió reguladora de l'operó mabA-inhA. Un 28,6 % de les soques no van presentar alteracions en aquests loci. Totes les soques resistents a la Rifampicina van presentar mutacions a la regió central del gen rpoB. La soca que presentava una mutació en el codó 516 era sensible a la rifabutina. El 30% de les soques resistents a la STR presentaven mutacions en el gen rpsL un altre 30% al gen rrs. La soca resistent a la PZA presentava una deleció de 9 nucleòtids al gen pncA. Les soques resistents dels pacients llatinoamericans i espanyols comparteixen el mateix llinatges d'espoligotip (LAM).

Las micobacterias, especialmente las especies del complejo tuberculosis, son responsables de numerosas infecciones en humanos. La OMS ha declarado la tuberculosis (TB) como una emergencia global, cada año mueren aproximadamente 3 millones de personas de TB y se desarrollan alrededor de 9 millones de nuevos casos. Durante algunos años se creyó que se podría erradicar la TB en los países desarrollados, sin embargo, la incidencia de la TB en estos países no ha seguido la línea descendente que se había proyectado. A pesar de que el 80% de la TB está concentrada en 22 países, la reemergencia en el primer mundo ha sido influenciada por el gran movimiento migratorio desde países con alta incidencia de TB (a la vez con graves problemas de multiresistencia); la existencia de bolsas de pobreza en el mundo industrializado y el desmantelamiento de algunos programas de control de la TB. Para el control de la TB es necesario el diagnóstico precoz con el objetivo de interrumpir la cadena de transmisión. Los métodos tradicionales de diagnóstico microbiológico no son eficientes dada su lentitud. En los últimos 20 años se han desarrollado nuevos métodos de aislamiento, identificación, estudios de sensibilidad y tipificación tanto para M. tuberculosis como para el resto de micobacterias. Aunque con menor importancia en el ámbito de salud pública que M. tuberculosis, la frecuencia de aislamientos de micobacterias no tuberculosas (MNT) va aumentando, y al mismo tiempo, se van describiendo nuevas especies susceptibles de producir patología en humanos. En el año 1975 el género Mycobacterium comprendía alrededor de 30 especies, actualmente se han descrito alrededor de 150. Para orientar el tratamiento de las diferentes micobacterias es necesario llegar a la identificación a nivel de especie, incluso dentro del complejo tuberculosis. Los estudios de sensibilidad en M. tuberculosis son particularmente importantes tanto para la monitorización de las tasas de resistencia inicial en una comunidad, que influirán en los tratamientos empíricos de los casos de esta comunidad, como para la detección de cepas resistentes en pacientes con factores de riesgo. Los estudios de sensibilidad en las MNT se limitan a pocas especies, M aviumcomplex, M kansasii y micobacterias de crecimiento rápido no pigmentadas con significación clínica. Por todo esto, el laboratorio de micobacteriologia clínica juega un papel importante tanto en atención sanitaria cómo en el ámbito de la salud pública. Con el desarrollo de nuevas tecnologías se ha conseguido dar resultados adecuados y con el mínimo de tiempo posible. Tradicionalmente se han utilizado técnicas fenotípicas para la identificación y estudios de sensibilidad, actualmente están viéndose complementadas por las técnicas basadas en la biología molecular, incluso aplicables directamente en la muestra clínica. Los objetivos principales de esta tesis han sido la evaluación de los métodos de diagnóstico del laboratorio de micobacteriología ( examen directo, amplificación de ácidos nucleicos, aislamiento por cultivo e identificación) y el seguimiento de las resistencias a los antituberculosos en casos nuevos y pacientes con tratamiento previo. Otros tres objetivos secundarios han sido la evaluación de dos sistemas no radiomètricos (MB/BacT ALERT® y BACTEC MGIT 960®) para el estudio de la sensibilidad a los antituberculosos de primera línea, la caracterización molecular de los mecanismos de resistencia a los fármacos de primera línea y la descripción de los diferentes linajes de las cepas de M. tuberculosis resistentes aisladas en el Hospital de la Santa Creui Sant Pau. A lo largo del periodo estudiado se ha observado un aumento del aislamiento de MNT, coincidiendo con la pandemia del SIDA, así como una disminución a partir de la introducción del tratamiento combinado de alta eficacia. También se ha observado un descenso global en los aislamientos de M. tuberculosis, debido a la disminución en pacientes autóctonos, aunque se observa un incremento de pacientes inmigrantes. La sensibilidad de la baciloscopia en el diagnóstico de la tuberculosis respiratoria ha sido del 52.2%, siendo el esputo la muestra más sensible (64,4%). En la tuberculosis extrarespiratória la sensibilidad de la baciloscopia ha sido del 23,7%, siendo las muestras osteoarticulares las más frecuentemente positivas (35,7%). La especificidad ha sido del 99,9% con un VPP del 99,4%. Globalmente se ha observado una mayor capacidad de aislamiento de los medios de cultivo líquido. El efecto inóculo es más significativo en aquellas muestras con bacilocopia negativa, lo que corrobora la importancia de la utilización de los dos tipos de medio de cultivo en el aislamiento. La especificidad de la AMTD para la detección de ácidos nucleicosdel complejo M. tuberculosis ha sido buena (99.8%). La sensibilidad en muestras con bacilocopia positiva fue del 94.2%, disminuyendo considerablemente muestras baciloscopia negativa (especialmente en la tuberculosis extrarespiratoria). El porcentaje de resistencia global en nuevos casos ha sido del 7,9%, significativamente más alta en pacientes inmigrantes (16,7%) que en pacientes autóctonos (5,7%). La resistencia global en pacientes con tratamiento previo fue del 15.1%, significativamente más alta en pacientes inmigrantes (46,2%) respecto a los pacientes autóctonos (5%). Sólo se detectómultiresistència en pacientes inmigrantes. Los sistemas MB/BacT ALERT y BACTEC MGIT 960 son una buena alternativa no radiométrica al sistema BACTEC 460 para el estudio de sensibilidad a los fármacos de primera línea. En cuanto a los fármacos de segunda línea, todas las cepas con resistencia a la ethionamida presentaban resistencia cruzada con la isoniazida, siendo esta en el 75% de bajo nivel. El 75% de las cepas resistentes a la RIF presentaban resistencia cruzada con la rifabutina. No se han encontrado resistencias en otros fármacos de segunda línea. La resistencia a la INH se ha debido en el 39,3% de los casos a alteraciones en el codón 315 del gen katG y en el 32,1% a la región reguladora del operón mabA-inhA. Un 28,6% de las cepas no presentaron alteraciones en estos loci. Todas lascepas resistentes a la Rifampicina presentaron mutaciones en la región central del gen rpoB. La cepas que presentaba una mutación en el codón 516 era sensible a la rifabutina. El 30% de las cepas resistentes a la STR presentaban mutaciones en el gen rpsL otro 30% al gen rrs. La cepas resistente a la PZA presentaba una deleción de 9 nucleótidos en el gen pncA. Las cepas resistentes de pacientes latinoamericanos y españoles comparten el mismo linaje de espoligotipo (LAM).

WHO has declared tuberculosis (TB) as a global emergency, every year die about 3 million people and 9 million new cases develop. For some years it was believed that TB could be eradicated in developed countries. However the incidence of TB in these countries hasn’t followed the diminishing line that had been projected. Although the 80% of Tb has been concentrated in 22 countries, the large migratory movement to developed countries from countries with high TB incidence has played an important role in this emergence. Multiresistence, the existence of poverty bags in the industrialized world and the abolishment of TB control programmes, have also contributed. Early diagnosis is required for TB control in order to break the transmission chain. The traditional methods for microbiological diagnosis take time and therefore are not efficient enough. During the last 20 years, new methods have been developed for isolation, identification, susceptibility tests and typing of both M.tuberculosis and the other mycobacteria. While in 1975 the genera Mycobacterium included about 30 species, over 150 species have been described so far. Species identification is required to guide the treatment for different mycobacteria, even within the M. tuberculosis-complex. M. tuberculosis susceptibility test are particularly important not only for resistance monitoring, which is going to influence empirical treatments, but also for detectation of those resistant strains in patients with risk factors, therefore allowing aproppiate treatment. MNT susceptibility test are constrained in a few species, M. avium complex, M. kansasii and non-pigmented rapid-growing mycobacteria with clinical importance. For this reason, the clinical mycobacteriology lab has an important role both in public health and healthcare, New techniques were developed along these years in order to improve the response time from the lab, including several liquid media systems (both radiometric and non-radiometric) for isolation and susceptibility tests. Although traditionally phenotypic tests were used for identification, nowadays molecular techniques are used more a more, and they have been applied even on clinical specimens. The main aims of this thesis were the evaluation of several methods of diagnosis in the mycobacteriology lab (direct microscopically examination, nucleic acid amplification, isolation and identification) and the surveillance of antituberculosis chemotherapy resistance in new cases and new patients. As secondary objectives this thesis included the evaluation of two non-radiometric systems (MB/BacT ALERT® and BACTEC MGIT 960®) for the susceptibility studies of first-line antituberculosis drugs, the molecular characterization of the resistance mechanisms of these drugs and the description of several of several lineages resistant M. tuberculosis strains isolated at the Hospital de la Santa Creu i Sant Pau. Along this period of time, there was initially an increase of MNT isolations coinciding with the AIDS pandemics, followed by a decrease after TARGA introduction. There has also been a global decrease of MTB isolations due to decrease of autochthonous patients despite the increase of immigrant patients. Sensitivity of microscopy examination in the pulmonary TBC was 52.2%, and sputum was the sample with higher sensitivity.(64,4%). In extrapulmonary TBC, the general sensitivity was 23.7% and osteoarticular samples showed the highest positive values (35,7%). Specificity was 99,9% and PPV was 99,4%. Globally the isolation performance was better in liquid media. The inoculum effect is more significant in those samples with negative microscopy examination, which highlights the importance of using both a liquid and solid medium. AMTD specificity for MTB complex was good (99,8%). AMTD sensitivity in positive microscopy examinations was 94,2%, although this value decreased considerably in negative examinations (especially in extrapulmonary TBC). The global resistance in new cases was 7.9%, corresponding to 16.7% in immigrant patients and 5.7% in autochthonous patients. Whereas the global resistance in patients with previous treatment was 15.1%,,it was significantly higher in immigrant patients (46.2%) than in autochthonous patients (5%). Multiresistance was only found in immigrants. MB/BacT ALERT and BACTEC MIGIT 960 systems are a good non-radiometric alternative to the BACTEC 460 for the first-line drug susceptibility studies. Regarding second-line drugs, all ethionamide-resistance strains showed cross-resistance to Isoniazide (75% of the cases displaying a low resistance). 75% of RIF-resistant strains showed cross-resistance to rifabutine. No other resistance to second-line drugs was found. IHN-resistance was mainly due to mutations in the 315 codon of the gene katG (in 39,3% of the cases) and in the mabA-inhA regulating region (32,1%). The rest of the isolated strains (28,6 %) didn’t show mutations in these loci. All rifampicin-resistant strains showed mutations in the central region of gene rpoB. Out of all STR-resistant strains, 30% showed mutations in the gene rpsL and 30% in the gene rrs. The only isolated strain with resistance to PZA, showed a 9-nucleotide deletion in the gene pncA. Isolation of LAM strains was equally distributed in Spanish and Latino American patients, quite in agreement with other reports. In these cases, it was difficult to determine whether they were imported strains due to their common phylogenetic origin. The lineage Haarlem was the most prevalent in Europe and wasn’t isolated in immigrants. Out of the 45 strains included in the study, two cases belonged to Asiatic patients, one of them corresponded to EIA-Manilla (belonging to a Philippine patient) and the other was non-classifiable. In this case the phylogenetic difference between autochthonous and endemic strains in our area makes the strain importation phenomenon more evident. A Beijing strain displaying streptomycin resistance was isolated from an autochthonous patient belonging to a mixed-grouping in which the index case was an immigrant patient.