Detecció i estudi de gens implicats en el desenvolupament prenatal de la rata

Abstract

Introducció<br/>El treball "Detecció i estudi de gens implicats en el desenvolupament prenatal de la rata" parteix de la hipòtesi de treball de què la carcinogènesi i el desenvolupament són processos que comparteixen mecanismes de funcionament com són l'elevat índex de proliferació, la capacitat de migració cel·lular o l'angiogènesi sostinguda i que, per tant, deuen compartir els gens que els regulen. Amb aquest plantejament a l'horitzó, aquest treball té com objectiu detectar gens implicats en el desenvolupament per, en un futur proper, estudiar si estan o no implicats en la carcinogènesi. <br/>Per detectar gens durant el desenvolupament es va utilitzar una tècnica de fingerprinting, RNA arbitrarily primed PCR ( RAP-PCR). La RAP-PCR és una tècnica destinada a l'estudi d'expressió gènica diferencial que utilitza, com a material, RNA de les diferents mostres que es volen comparar. En primer lloc el RNA s'ha de convertir a cDNA mitjançant la retrotranscripció (RT) amb la utilització d'un primer de disseny arbitrari. El cDNA obtingut s'amplifica per una reacció de PCR que, en la RAP-PCR, presenta tres particularitats: temperatures baixes d'hibridació en els primers cicles, augment de concentració de sals a la mescla i la utilització d'un primer arbitrari, el mateix o no de la RT. El resultat és l'amplificació d'un determinat nombre de seqüències de DNA que, mitjançant una electroforesi, es visualitzen com un patró de bandes en un gel desnaturalitzant d'acrilamida, poden així comparar-se l'expressió de cada transcrit entre les diferents mostres.<br/><br/>Material i mètodes<br/>El material, per a la realització de la tècnica de RAP-PCR, es va obtenir mitjançant microdissecció de fetus (E17-E20) procedents de 7 rates (Rattus norvergicus) gestants de la de la soca OFA (línia Sprague-Dawley). Els segments microdissecats corresponien a subdivisions amb criteris anatòmics i embriològics, del tub digestiu des de l'estómac fins al recte. Dels diferents segments microdissecats es va realitzar l'extracció de RNA amb el mètode d'extracció amb tiocianat de guanidini i fenol-cloroform (Chomczynski i Sacchi, 1987). A partir del RNA es va realitzar la retrotranscripció, mitjançant l'acció de l'enzim M-MLV i amb la participació d'un primer arbitrari (D4S 2912-GT), obtenint-se, d'aquesta manera, una primera selecció de cDNAs. El cDNA obtingut es va amplificar per PCR, amb les característiques descrites prèviament, i utilitzant el mateix primer que en la retrotranscripció (D4S 2912-GT). Els productes de PCR varen ser sotmesos a electroforesi en gels de seqüenciació obtenint-se com a resultat un patró de bandes característic i reproduïble. Les diferents bandes es varen retallar dels gels, varen ser eluïdes en aigua i conservades a 4ºC. Després de l'estudi dels patrons d'expressió dels diferents seqüències en els gels d'acrilamida es varen seleccionar 10 bandes per a la seva clonació i posterior seqüenciació.<br/>Per a dur a terme la clonació, les bandes es varen lligar al plasmidi pCR2.1, per l'acció d'una lligassa durant 16 hores a 14ºC de temperatura. El producte del lligatge es va utilitzar per transformar, per xoc tèrmic, bacteris competents de l'espècie Escherichia coli (soca To F-10) que, després d'un temps curt de creixement, es sembraven a plaques de Petri que contenien LB-Agar. Després de 14-16 hores de creixement es seleccionaven les colònies de bacteris que havien incorporat el plasmidi amb l'insert i mitjançant PCR es confirmava la incorporació de l'insert de la mida (núm. de parells de bases) desitjada. Amb la informació proporcionada per la PCR s'efectuava la selecció de clons per realitzar la seqüenciació automàtica. Les seqüències obtingudes per la tècnica de la seqüenciació automàtica eren analitzades mitjançant el programa BLAST a les bases de dades de la NCBI i de la UCSC, obtenint-se un llistat d'homologies amb gens seqüenciats en diferents espècies i en el genoma humà, respectivament. <br/>A fi de confirmar els resultats i obtenir una informació precisa de la localització de l'expressió es va realitzar la tècnica de la hibridació "in situ" de la banda que, segons la seqüenciació, corresponia a un fragment d'hsp86. Per a tal fi es varen construir ribosondes sense i antisense a partir d'un dels clons bacterians que havien incorporat l'insert. Per a la construcció de les ribosondes, la banda va ésser transferida al plasmidi pBluescript SK, que posseeix promotors de T3 i T7 RNA polimerases (per a la síntesi de les sondes sense o antisense, respectivament), a diferència del pCR2.1 que només en posseeix un d'ells. La síntesi de les ribosondes es va realitzar mitjançant l'acció de les RNA polimerases T3 o T7, utilitzant nucleòtids marcats amb digoxigenina pel marcatge de la sonda i com a motlle el plasmidi linealitzat. La tècnica de la hibridació "in situ" es va efectuar sobre talls sagitals, realitzats en criòstat i adherits a portaobjectes, de fetus sencers de rata, fixats per perfusió amb Paraformaldehid al 4% en PB, procedents de 4 rates gestants de la de la soca OFA (línia Sprague-Dawley) de 17 a 20 dies de gestació.<br/>Resultats i discussió<br/><br/>Els resultats d'aquest treball varen ésser obtinguts a tres nivells: <br/>1. Patró de bandes en els gels d'acrilamida<br/>2. Anàlisi de les seqüències <br/>3. Hibridació "in situ"<br/><br/>1. Patró de bandes en els gels d'acrilamida: <br/>Els patrons de bandes en els gels d'acrilamida varen mostrar patrons d'expressió de les diferents bandes, que varen ser identificades per un codi de lletres i números. Aquests resultats varen proporcionar la informació per a decidir les bandes a seqüenciar però en cap cas varen ser considerats com a resultats definitius.<br/>2. Anàlisi de les seqüències: <br/>Donat que la metodologia de la RAP-PCR amplifica tot tipus de RNAs, en el nostre cas, hem obtingut tres seqüències de RNA ribosòmic (H3, N0 i N1.2), dues procedents del genoma mitocondrial (E3 i G1), tres RNAs missatgers (F8/hsp86, G0/CCT-5 i M2/GTP binding protein) i, finalment, dues seqüències (J2 i N1.1) han mostrat una seqüència desconeguda de nucleòtids. Respecte a les seqüències que varen mostrar màxima homologia amb RNAs missatgers l'anàlisi bioinformàtica ens va proporcionar la següent informació: <br/>La banda G0, que a la RAP-PCR s'expressa més intensament a la part més anterior del duodè, va mostrar homologia d'un 93% amb Mus Musculus Chaperonin subunit 5 (epsilon) (Cct5) i d'un 87% amb Homo Sapiens mRNA for KIAA0098 protein. KIAA0098 és homologa a nivell del seu exó 1 amb Homo Sapiens mRNA activated in tumor supression, clone TSAP9 que s'ha clonat en un estudi en el que es va considerar com un probable gen supressor de tumors, donada la seva expressió diferencial en dues línies cel·lulars, l'una tumoral i l'altre no. (Roperch JP et al. (1999). SIAH-1 promotes apoptosis and tumor supression through a network involving the regulation of protein folding, unfolding, and trafficking: Identification of common effectors with p53 and p21Waf1 . Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 8070-8073).<br/>La banda M2, que a la RAP-PCR s'expressa a les diferents localitzacions sense diferencies remarcables, ha mostrat homologia d'un 92% amb Mus musculus largeG mRNA for large GTP binding protein i d'un 84% amb Homo sapiens optic atrophy 1 (autosomal dominant) (OPA1) , per la qual cosa considerem que és homòloga al gen de l'atròfia òptica tipus 1, a nivell del seu domini GTP.<br/>La banda F8, que a la RAP-PCR s'expressa a les mostres corresponents a les parts més distals del tub digestiu, va mostrar homologia d'un 98-100% amb Rattus norvegicus hsp86 gene for heat shock protein 86, homòloga a la hsp 90a humana.<br/>3. Hibridació "in situ" : <br/>La Hibridació "in situ" amb les sondes construïdes a partir de la banda F8, corresponent a un fragment del gen de la hsp86 de la rata, va mostrar els següents resultats: la sonda sense no va mostrar hibridació a cap dels talls estudiats i la sonda antisense va mostrar un patró d'expressió molt conservat a les diferents edats del període fetal de la rata. Les localitzacions en les que va hibridar la sonda antisense, amb diferents intensitats de marcatge, són, amb una ordenació craniocaudal, les següents: escorça cerebral, capa ependimaria dels plexes coroïdals, epiteli de les cavitats nasal i nasofaringea, glàndules salivals, glàndules glossopalatines, epiteli de revestiment dels bronquis de gran mida, timus, greix bru, ganglis raquidians, cèl·lules hematopoètiques o hepatòcits a nivell hepàtic, epiteli i serosa del intestí prim i gros, escorça renal i suprarenal i cèl·lules germinals del testicle.<br/>Dels resultats obtinguts en la HIS amb la sonda F8 destaquem que existeix expressió del gen de la hsp86 en els epitelis nasal i bronquial, revestiment ependimari dels plexes coroïdals i en cèl·lules germinals del testicle, localitzacions en les què les cèl·lules presenten cilis o flagels. Els cilis i flagels estan formats per una estructura interna, l'axonema, constituïda, en vertebrats, per nou doblets de microtúbuls que n'envolten a dos centrals. Cada microtúbul esta format per protofilaments constituïts per heterodímers d'a i b tubulina. Es coneix bé que la hsp90a es la xaperona que col·labora en el plegament de les tubulines, pel que considerem que l'expressió de la sonda F8 en les localitzacions en les que hi ha elements mòbils, es deu a aquest fet. <br/>S'ha relacionat hsp90a amb càncer degut a què aquestes proteïnes col·laboren en el plegament de proteïnes necessàries pel creixement i la divisió cel·lular. Per altre banda, Mizuno et al (2001) recentment han descrit la interacció de hsp90a i hsp90b amb Pim-1, un protooncogén relacionat amb proliferació cel·lular en limfomes i leucèmies. Així mateix, s'ha observat sobrexpressió d'hsp90a en diferents tipus de càncer (d'endometri, de pàncrees, de mama, de nasofaringe, de glàndules salivals i en leucèmies), alguns dels quals es desenvolupen en teixits a on s'expressa la sonda F8 durant el període fetal de la rata. Tots aquests fets recolzen la relació de hsp90a amb hiperproliferació i càncer.<br/>Recapitulant, veiem que en aquest treball hem trobat dues seqüències G0 (Chaperonin subunit 5 (epsilon)) i F8 (hsp 86) que podem relacionar amb càncer, el primer com a probable gen supressor de tumors i el segon com a gen relacionat amb proliferació cel·lular. Creiem que després d'aquest treball, en el que només es pretenia identificar gens del desenvolupament, la porta que pretenem travessar en la següent fase, per relacionar genèticament càncer i desenvolupament, està una mica més oberta.

Introduction<br/>"Detection and study of gens implicated in the prenatal development of the rat" is a doctoral thesis based on the working hypothesis that carcinogenesis and development are processes that share functional mechanisms, such as high proliferation index, celular migration ability and sustained angiogenesis, and consequently it must share the gens that regulate them, too. With this idea in mind the objective of this work is the detection of development implicated gens in order to, in a future, determine its implication in carcinogenesis. <br/>In order to detect genes during development the fingerprinting technique RNA arbitrarily primed PCR (RAP-PCR) was used. RAP-PCR is a technique for the study of differential genic expression that use RNA from different samples to be compared. First, RNA is transformed in cDNA through retrotranscription (RT) using of an arbitrary primer. cDNA is then amplified by a PCR that, in RAP-PCR, displays three peculiarities: low hibridization temperatures in the first cicles, an increase in the concentration of salts in the mix and the use of an arbitrary primer, the same of the RT or not. The result is the amplification of a determined number of sequences of DNA that can be observed as a fingerprinting pattern in a denaturalising acrilamide gel, thus permitting to compare transcrit expression between two samples.<br/><br/>Material and Methods<br/>For the RAP-PCR technique, the material was obtained by microdissection of fetusses (E17-E20) from 7 pregnant rats (Rattus norvergicus) of the OFA strain (Sprange-Dawley line). The microdissected segments corespond to subdivisions with anatomic and embryologic criteria, from stomach to rectum. The RNA extraction from the microdissected segments was done by the Guanidium tiocianate extraction method (Chomczynski & Sacchi, 1987). Once the RNA was obtained, the retrotranscription was done, through the action of the M-MLV enzime and the participation of an arbitrary primer (D4S 2912-GT), obtaining, in this way, a first cDNA selection. The cDNA was amplified by PCRs, with the previously described characteristics, and using the same primer than in the retrotranscription (D4S 2912-GT). PCR's products were submited to electrophoresis in sequentiation gels, obtaining a characteristic and reproducible pattern. The different bands were cuted out from the gels, eluted in water and keeped at 4ºC. After analyzing the expression patterns of the different transcrits in acrilamide gels, ten bands were selected for its clonation and posterior sequentiation.<br/>To carry out the clonation the bands were ligated to pCR®2.1 plasmidium, by the action of a ligase enzime during 16 hours at 14ºC. The ligation product was used to transform by thermic shock competent E Coli bacteriums (To F-10 strain) that, after a short growing period, were sow in Petri plaques containing LB-Agar growing media. After 14-16 hours of growing, the bacterial clones that had incorporated the plasmidium with the insert were choosed and was confirmed by PCR which of them had the insert with the expected size, in order to select them for the automatic sequentiation. The obtained sequences were analized through BLAST programe in the NCBI and UCSC data bases, obtaining, in this way, homologies with gens in different species and in human genome, respectively.<br/>In order to confirm the results and to obtain accurate information on the localization of the expression, "in situ" hibridization technique of the band that, according to sequentiation, corresponded to a hsp86 fragment, was performed. For that purpose riboprobes sense and antisense were constructed from one of the bacterial clones that had incorporated the insert. For the construction of the riboprobes, the band must be transferred to the pBluescript SK plasmidium, that possesses promotors of the T3 and T7 RNA polimerases (for the sintesis of the sense and antisense probes, respectively), diferently of pCR2.1 that only has one of them. Riboprobes Synthesis of the was done by the action of RNA polimerases T3 and T7, using digoxigenin marked nucleotides, in order to mark the probe, and the linealizated plasmidium as mould. The "in situ" hibridization was done over sagital sections, carried out in criostate and adhered to glass slides , of whole rat fetuses, fixed by perfusion with 4% Paraphomaldehid in PB, obtained from 4 pregnant rats of the OFA strain (Sprague-Dawley line) at the 17-20 days of pregnancy.<br/><br/>Results and discussion<br/>Results of this work were obtained in three levels: <br/>1. Band pattern in the acrilamide gels<br/>2. Sequences analysis <br/>3, "In situ" hybridization<br/><br/>1. Fingerprinting pattern in the acrilamide gels: <br/>Fingerprinting patterns showed expression patterns of the diferent bands, that were identified by a number and a letter code. These results gave us the information for deciding wich which bands to be sequenciate, but in no case this was considered to be definitive.<br/>2. Sequence analysis:<br/>Due to the fact that RAP-PCR amplifies all kinds of RNA, we have obtained in our study three sequences of rRNA (H3, N0, N1.2), two from the mitochondrial genome (E3 and G1), three mRNA (F8/hsp86, G0/CCT-5 i M2/GTP binding protein). Finally, two sequences (J2 i N1.1) have shown a unknown nucleotid sequence. In respect to the sequences that showed the highest homology with mRNA, the bioinformatic analysis gave us the following information: <br/>The G0 band, that in the RAP-PCR is more intensivily expressed in the more anterior part of the duodenum, showed 93% of homology with Mus Musculus Chaperonin subunit 5 (epsilon) (Cct5) and 87% with Homo Sapiens mRNA for KIAA0098 protein. KIAA0098 is homologue in exon 1 with Homo Sapiens mRNA activated in tumor supression, clone TSAP9 that was cloned in a study where it was considered a probable tumor supressor gen, due to its differential expression in two celular lines, one tumoral and not the other (Roperch JP et al. (1999). SIAH-1 promotes apoptosis and tumor supression through a network involving the regulation of protein folding, unfolding, and trafficking: Identification of common effectors with p53 and p21Waf1 . Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 8070-8073).<br/>The M2 band, that in RAP-PCR is expressed with no remarkable differences between different localizations, has shown 92% of homology with Mus musculus largeG mRNA for large GTP binding protein and 84% with Homo sapiens optic atrophy 1 (autosomal dominant) (OPA1) , two reasons to consider it homologue with optic atrophy 1 gene, in its GTP dominium.<br/>The F8 band, that in RAP-PCR, is expressed in the more distal parts of the digestive tube, showed 98-100% homology with Rattus norvegicus hsp86 gene for heat shock protein 86, homologue to hsp 90a. <br/>3. "In situ" Hibridization: <br/>The "in situ" hibridization with probes constructed from F8 band, that corresponded to a fragment of the hsp86 gene of the rat, showed the following results: Sense riboprobe showed no hibridization in the studied sections and the anti-sense showed an expression well conserved pattern in the different ages of the fetal period of the rat. Localizations where antisense probe hibridizated, with different mark intensities, were the following, in a craniocaudal order,: Cerebral cortex, ependimary layer of the choroidal plexus, epithelia of the nasal and nasopharinx cavities, salival glands, glosopalatine glands, surface epithelium of the larges bronchii, thimus, brown fat, raquidial ganglia, hematopoyetic cells or hepatocites in the liver, epithelia and serose layer in the small and large bowel, renal and suprarenal cortex and germinal cells in the testes.<br/>From our results obtained by "in situ" hibridization with the F8 probe we emphasize that expression of the hsp86 gene exists in the nasal and brochial epithelia, ependimary layer of the choroidal plexus and germ cells of the testes, all of them locations where cells display cilia or flagelae. Ciliae and flagelae are formed by and internal structure, axonem, consisting in vertebrates, by nine protophylaments constituted by a and b tubulin heterodimers. Is well known that hsp90a is the chaperon that collaborates in the folding of tubulines, reason for which we consider that the expression of the F8 probe in the locations with mobile elements is due to this fact. <br/>Hsp90a has been related to cancer because these proteins collaborate in the folding of the proteins neededfor celular growth and division. In the other way Mizuno et al. (2001) have recently described the interaction of hsp 90a and hsp90b with pim-1, a protooncogen related to celular proliferation in leukemias and limphomas. It has similarly been observed overexpression of hsp90a in different cancers ( endometrium, pancreas, breast, nasopharinx, salival glands and leukemias ), some of them developed in tissues where F8 probe is expressed during the rat fetal period. All these facts support the relation between hsp90a with hyperproliferation and cancer.<br/>Summarizating, we have found in this work two sequences G0 ( Chaperonin subunit 5 (epsilon)) and F8 (hsp86) that can be related to cancer, the first as a probable tumor supressor gene and the second as a gen related to celular proliferation.. We belive that, after this study, that only pretended to identify development gens, the door that we pretend to cross is now a little more open, for genetically relate cancer and development in the next phase.