Caracterización de la actividad bactericida de la proteína catiónica de eosinófilos (RNasa 3/ECP) y la RNasa derivada de epidermis (RNasa 7). Estudio por proteólisis limitada y mutagénesis dirigida

Abstract

La superfamilia de las ribonucleasa A incluye proteínas de propiedades muy diversas, entre ellas RNasas altamente catiónicas con propiedades antipatógenas como: bactericida, antihelmíntica y antivírica. Las dos principales RNasas con capacidad bactericida son la RNasa 3, también conocida como Proteína Catiónica de Eosinófilos, (RNasa 3/ECP), y la RNasa 7, denominada también RNasa derivada de piel. La RNasa 3/ECP fue originalmente identificada como factor liberado por eosinófilos y sus niveles fisiológicos son marcadores ya establecidos en el asma y en varios tipos de inflamaciones y/o infecciones. En este proyecto se plantea establecer cuál es el mecanismo molecular de acción bactericida de la RNasa 3, que presenta abundancia de argininas en su superficie, así como estudiar la potencial participación de la actividad ribonucleasa en el proceso. La RNasa 7 es otra ribonucleasa implicada en el sistema inmunitario de defensa, de carácter igualmente catiónico, en este caso debido a la abundancia de lisinas en su superficie. El conocimiento de esta proteína procede de su purificación a partir de un extracto de epidermis. Su actividad ribonucleasa en las descamaciones epiteliales puede ser uno de los principales factores de degradaciones del RNA en las manipulaciones de laboratorio. Su mecanismo de acción aún está por estudiar en detalle. Esta proteína presenta una actividad RNasa superior en relación a la RNasa 3/ECP y al mismo tiempo una actividad bactericida ligeramente superior. La hipótesis de trabajo para el estudio de la RNasa 3/ECP es la identificación de las regiones determinantes de su actividad bactericida. Para ello se han realizado varias aproximaciones: a) la utilización de péptidos resultantes de escisión química y enzimática limitada b) la utilización de péptidos sintéticos y c) la utilización de mutantes en modelos de expresión a pequeña escala que expresan la proteína en su forma soluble. Por otra parte, el presente trabajo representa la puesta a punto del primer protocolo de expresión de RNasa 7 recombinante con elevado rendimiento. Se realizó un estudio comparativo entre las dos variantes de la RNasa 7 identificadas a partir de cDNA de queratinocitos (variante P75Y93) y de cDNA proveniente de riñón (variante A75H93). La hipótesis de trabajo para el estudio de la RNasa 7 es la caracterización de su actividad antibacteriana para las dos variantes identificadas comparándolas entre ambas y al mismo tiempo con la RNasa 3. Las propiedades diferenciales de estas proteínas nos facilitarán la comprensión de su función in vivo, durante el proceso de respuesta inmunitaria. Adicionalmente se pretende poner a punto, nuevos protocolos de cocristalización de la RNasa 3/ECP con potenciales ligandos naturales, para identificar los residuos de interacción con componentes de la pared bacteriana. Para la determinación de péptidos derivados de la 3/ECP RNasa vamos a elegir diferentes enfoques: los péptidos resultantes de la escisión enzimática o química, el análisis de péptidos sintéticos de la N-terminal. Los péptidos se separaron por filtración en gel o cromatografía en fase reversa.

RNase A superfamily includes proteins of wide functions, among them highly cationic RNases with anti pathogen features as well as: bactericidal, anti helminthic and antiviral. The two main RNases with most bactericidal potential are RNase 3, also called as Eosinophil Cationic Protein (RNase 3/ECP), and the RNase 7, also called skin derived RNase. RNase 3/ECP was originally identified as a factor released by eosinophils and its physiologic levels are stated markers for asthma, allergia and some kinds of infections. We propose in this project to establish which could be the molecular mechanism of antibacterial activity, both concerning their surface interactions with cationic residues, due to abundance of arginines, with cell walls s and cellular membranes, as well as the study the potential involvement of ribonuclease activity in its mechanism of action. RNase 7 is another ribonuclease involved in immune defense, also a cationic protein, in this case due to the abundance of lysines on its surface. The knowledge about this protein comes from its purification from an extract of epidermis. Its ribonuclease activity in epithelial desquamation may be one of the main factors of degradation of RNA in the laboratory manipulations. Its mechanism of action remains to be studied in detail. This protein has a higher RNase activity in relation to RNase 3/ECP while bactericidal activity is slightly higher The working hypothesis for the study of RNase 3/ECP is the identification of regions that determine its bactericidal activity. To achieve this purpose, we performed several approaches: a) the use of peptides resulting from chemical and enzymatic limited cleavage b) the use of synthetic peptides and c) the use of mutant in expression models at that express at low levels the protein in its soluble form. It is also provided a comparative study between two variants of RNase 7 from cDNA identified from keratinocytes (P75Y93 variant) and cDNA from kidney (A75H93 variant). The working hypothesis for the study of RNase 7 is the characterization of its antibacterial activity for the two variants identified by comparison between them and with the RNase 3. The differential properties of these proteins will facilitate our understanding of their role in vivo during the immune response. Additionally it is intended to develop new protocols for co-crystallization of RNase 3/ECP with potential natural ligands to identify residues interacting with the bacterial wall. For the assay of peptides derived from the RNase 3/ECP we will choose different approaches: peptides resulting from enzymatic or chemical cleavage, synthetic peptide analysis of the N-terminal. The peptides were separated by gel filtration or reverse phase chromatography.