Evolutionary recruitment and assembly of embryonic alternative splicing programs: insights form the Deuterostomia lineage

Abstract

In the present work, we studied the evolution of alternative splicing (AS) from different perspectives. First, we performed a preliminary analysis where we identified alternative exons with tissue-specific regulation in five species of deuterostomes: Homo sapiens, Danio rerio, Callorhinchus milii, Branchiostoma lanceolatum and Strongylocentrotus purpuratus. Seven different organs from each animal were employed, trying to use homologous tissues when possible (especially among vertebrates). Results revealed a higher relative proportion of organ-biased AS regulation in the nervous system of chordates, with respect to the rest of organs. From the other hand, sea urchin species showed more balanced amounts of organ-specific AS regulation. Moreover, human samples showed a tissue-specific trend towards increased levels of differential exon skipping in general.

In this thesis, we also investigated the expression and function of RbFox and Nova genes in non-vertebrate deuterostome organisms to study the evolutionary scenario of both families. The two gene families code for RNA-binding proteins that regulate wide sets of alternative splicing events in vertebrate organisms. We found Nova function to be related to gastrulation movements during embryogenesis, but not endoderm specification. In all adult Bilateria organisms studied, RbFox genes are strongly expressed in the nervous system. But, strikingly, non-vertebrate deuterostomes present developmental expression in mesoderm tissues, especially in the myogenic lineage. Interestingly, RbFox activity has been co-opted in the central nervous system of bony vertebrates, as well as in the skeletogenic mesoderm of S. purpuratus. In this last species, RbFox is necessary for both the formation of circumesophageal muscles and the development of the larva skeleton. At the splicing level, Nova ortholog in sea urchin regulates splicing of a very vast set of exons, while the number of RbFox-dependent exons is much lower. Among the targets of the latter, we detected the Fgfr1 gene, that have been previously described as necessary in terms of muscle differentiation in this organism.

Finally, we studied Esrp gene family, which codes also for a splicing factor. We investigated the expression and function of this gene family in several species of deuterostomes. In zebrafish, Esrp1 and Esrp2, are involved in the organogenesis of multiple structures, arguably by controlling epithelial-mesenchymal interactions. In Ciona intestinalis, Esrp ectopic expression is able to modulate the motility of mesenchymal migratory cells. In amphioxus, Esrp is expressed in the precursor of the epidermic sensory neurons at the time they ingress in the dorsal ectoderm. In S. purpuratus, Esrp is found in both aboral ectoderm and in the pigment cells during gastrulation. In fact, the gene is needed for a complete integration of those cells in the non-neural ectoderm. We detected multiple regulated exons that are shared among bony vertebrate organisms in terms of Esrp-regulated splicing, and we even found a case conserved also in amphioxus in Fgfr genes. However, no regulated exons have been detected as conserved between vertebrates and sea urchin, although several common targets are found at the gene level.

En la presente tesis se ha estudiado la evolución del splicing alternativo (AS) desde diferentes perspectivas. Primeramente, se ha hecho un análisis preliminar en el que se han identificado exones alternativos con regulación específica de tejido, en cinco especies de deuteróstomos: Homo sapiens, Danio rerio, Callorhinchus milii, Branchiostoma lanceolatum y Strongylocentrotus purpuratus. Se emplearon siete órganos diferentes para cada animal, intentando utilizar muestras de órganos homólogos cuando era posible (especialmente entre vertebrados). El resultado reveló una proporción relativa mayor de splicing alternativo específico de tejido en el sistema nervioso de los cordados, respecto al resto de órganos. En erizo de mar, en cambio, se observaron valores más parecidos de AS entre los diferentes tejidos. La especie humana en particular mostró una tendencia mucho mayor a un exclusión diferencial de exones en general.

Por otro lado, también se ha estudiado la expresión y/o función de los genes RbFox y Nova en organismos deuteróstomos no vertebrados para estudiar el escenario macroevolutivo de dichas familias. Ambos genes codifican para proteínas de unión a RNA que regulan conjuntos amplios de eventos de AS en organismos vertebrados. Encontramos que la función de Nova en erizo de mar está relacionada con los movimientos de gastrulación embrionaria. En el caso de RbFox, la expresión y función descrita en organismos adultos parece diferir de la que sucede durante el desarrollo embrionario. En todos los adultos Bilaterales estudiados, los genes RbFox se expresan en el sistema nervioso central mayoritariamente, mientras que los deuteróstomos no vertebrados, la expresión se observa en mesodermo embrionario mayoritariamente. Es interesante destacar que la expresión de RbFox en embriones ha sido co-optada tanto en el sistema nervioso de vertebrados durante el desarrollo, así como en el mesodermo esqueletogénico del erizo de mar. En esta última especie, RbFox es necesario tanto para la formación de los músculos circumesofágicos como para la formación del esqueleto larvario. A nivel de splicing, el ortólogo de Nova en S. purpuratus regula el splicing de un conjunto muy grande de exones, mientras que el regulado por RbFox es más pequeño. Entre los targets de este último, se encuentra el gen Fgfr1, que ha sido descrito como necesario para la diferenciación muscular en esta especie.

Por último, se estudió la família génica Esrp, que también codifica para un factor de splicing. En el presente trabajo, se ha estudiado la expresión y función de dicha familia génica en diversas especies de deuteróstomos. En zebrafish, Esrp1 y Esrp2 están implicados en la organogénesis de múltiples estructuras. En Ciona intestinalis, Esrp modula la motilidad de las células mesenquimales migratorias. En anfioxo, Esrp se expresa en las precursoras de las neuronas epidérmicas sensoriales en el momento de introducirse en el ectodermo dorsal. En S. purpuratus, Esrp se encuentra tanto en el ectodermo aboral como en las células pigmentarias. De hecho, es necesario para una integración completa de estas últimas en el ectodermo no neural. A nivel de programa de splicing regulado, hemos detectado diversos exones regulados comunes entre vertebrados, e incluso uno con anfioxo en los genes Fgfr. Sin embargo, no se han detectado exones regulados conservados entre vertebrados y erizo de mar, aunque sí hay dianas comunes a nivel de gen.