CRP-cAMP mediated silencing of virulence expression in Salmonella enterica serovar Typhimurium

Abstract

The regulation of the expression of virulence genes in Salmonella enterica serovar Typhimurium is an intensively studied feature of Salmonella lifestyle. How Salmonella integrates environmental signals to activate virulence-related genes within the host has been explored. The genes encoded in Salmonella pathogenicity island I (SPI-1) required for the invasion of epithelial cells are well characterized, and many regulators involved in the activation of SPI-1 genes have been described. However, little is known about mechanism involved in the repression of SPI-1 under conditions were Salmonella does not require the expression of virulence-related genes. The expression of SPI-1 encoded genes have been reported to be a burden for Salmonella physiology and therefore mechanism to control shut down of SPI-1 under non permissive conditions might play a crucial role in Salmonella physiology. Here we describe that at exponential phase, CRP-cAMP, which acts as an activator at stationary phase, represses the expression of SPI-1 genes. The overall objective of this thesis was to characterize how CRP-cAMP silences SPI-1 expression under non-permissive conditions and to describe the molecular mechanism behind this phenotypic observation. In this thesis we i) define the target gene for the CRP-mediated regulation of SPI-1 ii) elucidate at which level of regulation CRP-cAMP modulates the expression of the SPI-1 genes master regulator hilD iii) characterize the involvement of CRP-cAMP dependent sRNA in hilD regulation iv) characterize the interaction of the CRP-cAMP dependent sRNA Spot 42 with the hilD 3’UTR region to regulate SPI-1 and v) explore the role of CRP-cAMP in the modulation of the SPI-1 repressor CsrA through the regulation of the long non-coding RNA csrB and csrC. CRP-cAMP represses hilA expression at exponential phase (non-permissive conditions for SPI-1 expression) and acts as an activator at stationary phase (permissive conditions for SPI-1 expression). CRP-cAMP mediated repression of hilA causes a concomitant attenuation in the expression level of SPI-1 encoded effector proteins. The regulation of SPI-1 during logarithmic growth phase occurs upstream of HilA by repressing hilD, hilC and rtsA expression and is mediated by the regulation of hilD expression at the post transcriptional level through the hilD 3’UTR. CRP-cAMP mediated regulation of hilD requires, in addition to the hilD 3’UTR, the sRNA chaperone Hfq and the major endonuclease RNAse E. CRP-cAMP represses the expression of the sRNA Spot 42 at exponential phase. We show that Spot 42 positively regulates hilD expression at exponential growth phase and requires of the presence of the hilD 3’UTR, the sRNA chaperone Hfq and the major endonuclease RNAse E. Interestingly, Spot 42 and the hilD 3’UTR region physically bind to Hfq. Spot 42 physically interacts with the last 150 nt of the hilD 3’UTR and unstructured region III of Spot 42 is required for the regulation of hilD. CRP-cAMP represses csrC but not csrB expression at exponential phase to regulate the expression of hilD. Remarkably, the CRP-cAMP dependent sRNA Spot 42 positively regulates the expression of csrC.

La regulación de la expresión de genes de virulencia en Salmonella enterica serovar Typhimurium es una característica intensamente estudiada en Salmonella. La forma en que Salmonella integra señales ambientales para activar los genes relacionados con la virulencia dentro del huésped ha sido explorada. Los genes codificados en la isla de patogenicidad I de Salmonella (SPI-1) son necesarios para la invasión de células epiteliales, están bien caracterizados y se han descrito muchos reguladores implicados en su activación. Sin embargo, poco se sabe sobre el mecanismo implicado en la represión de SPI-1 en condiciones en las que Salmonella no requiere la expresión de genes relacionados con la virulencia. Es sabido que la expresión de genes codificados por SPI-1 son una carga para la fisiología de Salmonella y por lo tanto el mecanismo para controlar la represión de SPI-1 en condiciones no permisivas podría desempeñar un papel crucial en la fisiología de Salmonella. Aquí se describe que en fase exponencial, CRP-cAMP, que actúa como un activador en fase estacionaria, reprime la expresión de los genes SPI-1. El objetivo general de esta tesis fue caracterizar cómo el CRP-cAMP silencia la expresión de SPI-1 en condiciones no permisivas y describir el mecanismo molecular detrás de esta observación fenotípica. El CRP-cAMP reprime la expresión de hilA en la fase exponencial (condiciones no permisivas para la expresión de SPI-1) y actúa como un activador en fase estacionaria (condiciones permisivas para la expresión de SPI-1). La represión mediada por CRP-cAMP de hilA provoca una atenuación concomitante en el nivel de expresión de proteínas efectoras codificadas por SPI-1. La regulación de SPI-1 durante la fase de crecimiento logarítmico se produce aguas arriba de HilA mediante la represión hilD, hilC y rtsA expresión y está mediada por la regulación de hilD a nivel post transcripcional a través de la hilD 3'UTR. La regulación mediada por CRP-cAMP de hilD requiere, además de la hilD 3'UTR, la chaperona Hfq y la endonucleasa RNAsa E. CRP-cAMP reprime la expresión del sRNA Spot 42 en la fase exponencial. Mostramos que Spot 42 regula positivamente la expresión hilD en la fase de crecimiento exponencial, Spot 42 interacciona físicamente con los últimos 150 nt de la hilD 3'UTR.