Desarrollo de modelos celulares y animales para el estudio de terapia génica no viral anti-angiogénica en retina

Abstract

La degeneración macular asociada a la edad (DMAE) y la retinopatía diabética (RD) pertenecen a un grupo de degeneraciones de retina con etiología compleja, influenciadas tanto por factores genéticos como ambientales. Aunque sus orígenes son distintos y sus mecanismos moleculares son complejos, ambas se caracterizan por una neurodegeneración progresiva con presencia de apoptosis en la retina, activación glial, estrés oxidativo y la aparición de neovascularización en sus fases más avanzadas. Estas dos enfermedades son las principales causas de pérdida de visión en los países industrializados, con más de 30 millones de personas afectadas de DMAE y más de 40 millones afectadas de RD en todo el mundo, suponiendo un elevadísimo impacto económico y médico. A pesar de su elevada prevalencia, actualmente no existen tratamientos eficaces para la ralentización o la reversión de estas patologías, siendo los más utilizados los anticuerpos anti-­‐VEGF administrados de forma intravítrea, con sus consiguientes efectos secundarios. En los últimos años la terapia génica se ha postulado como una de las opciones terapéuticas más prometedoras en el campo de la oftalmología, ofreciendo sistemas virales y no virales capaces de provocar la expresión del factor terapéutico por las propias células de la retina por períodos de tiempo muy prolongados. Sin embargo, el desarrollo de terapéuticos farmacéuticamente y clínicamente viables depende no sólo de tener un vector efectivo y seguro sino también de la disposición de buenos modelos animales para la realización de los estudios pre-­‐clínicos. El objetivo de este trabajo se ha centrado en el estudio de estrategias de terapia génica no viral para la sobre-­‐expresión de dos factores anti-­‐angiogénicos y neuroprotectores expresados normalmente en retina: la somatostatina (SST) y el factor derivado del epitelio pigmentado (PEDF). Para el abordaje de este objetivo primeramente se han generado modelos celulares de angiogénesis y se ha estudiado la eficacia anti-­‐angiogénica de los dos factores. También se han generado y caracterizado dos modelos animales, uno de RD inducido con estreptozotocina en rata y uno de DMAE mediante inducción de neovascularización coroidea con láser en ratón, determinando el grado de degeneración retiniana en ambos casos. En cuanto al estudio de sistemas de terapia génica no viral, primeramente se ha puesto a punto el modelo de administración sub-­‐retiniana en rata y ratón y se ha corroborado la capacidad de transfección de las células del epitelio pigmentado de la retina (EPR). Se han construido los vectores plasmídicos de expresión de PEDF y SST usando secuencias reguladoras optimizadas para expresión en EPR y se ha estudiado su capacidad de expresión en cultivos celulares de EPR. Finalmente, se han estudiado dos nanopartículas como sistemas de terapia génica no viral: las nanopartículas proteicas R9-­‐GFP-­‐H6 y los quitosanos O15. Estos sistemas se han caracterizado mediante su capacidad de unión al ADN y la eficacia de transfección se ha evaluado en cultivos celulares e in vivo en el EPR mediante inyección sub-­‐retiniana. En conclusión, este trabajo ha desarrollado un conjunto de herramientas para la evaluación de nuevos sistemas de terapia génica no viral para RD y DMAE y ha realizado los primeros estudios de eficacia con nanopartículas proteicas y quitosanos, abriendo nuevos caminos en la obtención de una estrategia terapéutica eficaz en el tratamiento de las principales retinopatías vasoproliferativas.

Age-­‐related macular degeneration (AMD) and diabetic retinopathy (RD) belong to a group of retinal degenerations with complex etiology, influenced by both genetic and environmental factors. Although their origins are different and their molecular mechanisms are complex, both are characterized by progressive neurodegeneration with retinal apoptosis, glial activation, oxidative stress and the emergence of neovascularization in its later stages. These two diseases are the main causes of vision loss in industrialized countries, with more than 30 million people affected by AMD and more than 40 million affected by DR over the world, assuming a very high economic and medical impact. Despite their high prevalence, there are currently no effective treatments for the slowing or reversal of these pathologies, being the most used the anti-­‐VEGF antibodies administered intravitreally, with their consequent side effects. In recent years gene therapy has been postulated as one of the most promising therapeutic options in the field of ophthalmology, offering viral and non-­‐viral systems capable of promoting the expression of the therapeutic factor by the retinal cells for long time-­‐periods. However, the development of pharmaceutically and clinically viable therapeutics depends not only on having an effective and safe vector but also on the provision of good animal models for conducting pre-­‐clinical studies. The objective of this work has focused on the study of non-­‐viral gene therapy strategies for the overexpression of two anti-­‐angiogenic and neuroprotective factors normally expressed in the retina: somatostatin (SST) and pigment epithelium-­‐derived factor (PEDF). In order to approach this objective, cellular models of angiogenesis have been generated and the anti-­‐angiogenic efficacy of the two factors has been studied. Furthermore, two animal models have been generated and characterized, the streptozotocin-­‐induced RD model in a rat and the laser-­‐induced choroidal neovascularization AMD model in a mouse, determining the degree of retinal degeneration in both cases. Regarding the study of non-­‐viral gene therapy systems, the sub-­‐retinal administration model in rat and mouse has been first developed and the transfection capacity of retinal pigment epithelial cells (RPE) has been corroborated. PEDF and SST-­‐expressing plasmid vectors have been constructed using regulatory sequences optimized for RPE expression and their expression capacity has been evaluated in RPE cultures. Finally, two nanoparticles as non-­‐viral gene therapy systems have been studied: the protein nanoparticles R9-­‐GFP-­‐H6 and the chitosans O15. These systems have been characterized for their DNA-­‐binding capacity and the transfection efficacy has been evaluated in cell cultures and in vivo in the RPE by sub-­‐retinal injection. In conclusion, this work has developed a set of tools for the evaluation of new non-­‐viral gene therapy strategies for the treatment of DR and AMD and has carried out the first studies of efficacy with protein and chitosan nanoparticles, breaking new ground in the procurement of an effective therapy in the treatment of the major vasoproliferative retinopathies.