Expression and characterization of a human sodium glucose transporter (hSGLT1) in Pichia pastoris

Abstract

En els últims 20 anys, la caracterització de proteines de membrana ha esdevingut un camp interessant per el disseny de fàrmacs però, la falta d’informació del seu mecanisme d’acció i estructura fa encara més difícil buscar noves dianes terapèutiques. Per tant, estudiar l’estructura i el mecanisme d’acció de proteines de membrana acceleraria la recerca de nous fàrmacs i les seves implicacions mèdiques. El projecte de tesis presentat aquí està centrat en explorar les característiques del transprotador de glucosa humà (hSGLT1). Aquest transportador està implicat en la absorció de glucosa intestinal i està relacionat directament amb diferents enfermetats com: glucosa galactose malabsorbation (GGM), diabetis i l’enfermetat d’Alzheimer. El mecanisme de funcionament d’aquest transportador esta parcialment caracteritzat malgrat que algunes característiques encara no estan clares i s’estan estudiant. No obstant, l’estructura tridemensional del transport no esta descrita i, actualment, és el màxim objectiu pel que fa a entendre com funciona el seu mecanisme i que permetria buscar més fàcilment i efectivament nous fàrmacs. Inicialment, per tal d’obtenir un cristall de proteïna per poder resoldre la seva estructura, es necessiten un gran número de pasos previs. Primer, la proteina d’interest ha de ser expressada en un sistema recombinant correctament i, les proteïnes de membrana no són fàcils d’expressar en tots els sistemes d’expressió. En segon lloc, les proteïnes de membrana humanes son encara més complicades d’expressar perquè es necessari treballar en un sistema d’expressió eucariote o, sinó, es molt probable que s’obtingui una proteïna funcionalment inactiva. hSGLT1 ha sigut obtingut recombinant només un cop per un sistema eucariote de llevat: Pichia pastoris. Aquest llevat ha sigut utilitzat en els últims 10 anys per expressar proteines de membrana perque, a diferència d’altres llevats, com Saccharomyces cerevisae, pot crèixer molt més i, per tant, obtenir molta més proteïna. Una altre avantatge d’aquest sistema d’expressió és l’estabilitat dels clons de P. pastoris ja que implica més reproducibilitat en l’expressió. Tot i així, algunes desavantatges presenta aquest sistem que s’han de superar per tal d’obtenir bons nivells d’epressió, com per exemple, la selecció de clons. Degut a tot aixó, el projecte que es presenta aquí esta basat inicialment amb els treballs previs realitzats amb P. pastoris. Aquesta tesis esta centrada en l’expressió, purificació i caracterització del transportador de glucosa humà (hSGLT1) expressat en un sistema d’expressió heteroluga de llevat (P.pastoris). Inicialment, dos vectors es van dissenyar: Un que expressa hSGLT1 fusionat amb eGFP i l’altre que no (WT). El constructe que expresa la proteina fusionada amb eGFP es va utilitzar per monotiroritzar l’expressió de manera més fàcil i ràpida i que, per tant, permet optimitzar les condicions d’expressió, com per exemple: temps d’inducció, temperature, medis.etc. Les proteines de membrana necessiten ser extrete de la membrana per poder-les purificiar i, per tant, es requereix de detergent. El constructe amb eGFP es va utilitzar també per buscar quin detergent era més òptim per extreure la proteïna. Tot i així, tots ambdós costructes (WT i eGFP) es van purificar i aïllar correctament però només el producte WT es va utilitzar per els següents experiments estructurals. Malgrat les dificultats de reproduir el que s’havia descrit anteriorment, la proteina finalment es va aconseguir sotmetre a assaijos de funcionalitat. L’assaig de binding es va fer a partir d’una tècnica inusual: voltage-clamp in planar lipid membranes. Aquesta tècnica permet mesurar transport (funció) del transportador sense la necessitat d’incorporarar-la en liposomes. La conclusió final que es pot extreure en aquest treball es que hSGLT1 es pot purificar correctament i que, per tant, obre un gran ventall de possibilitats en un futur, com per exemple, cristalitzar la proteina per tal de resoldre la seva estructura i el seu mecanisme.

In the last 20 years, the characterization of membrane protein has become an interesting field for drug design but, the lack of information regarding their mechanism of action makes it even harder to screen for new drug targets. Therefore, studying the structure and mechanism of action of membrane proteins should accelerate the research of new drugs and its medical implications. The project presented here is focused on exploring the features of a human sodium glucose co-transporter (hSGLT1). This transport is involved in absorbing and reabsorbing the glucose in the intestine and it’s linked and directly involved in some diseases like: glucose galactose malabsorbation (GGM), diabetes and even some mental diseases like Alzheimer’s diseases. The mechanism of action of this transporter is partially understood although some features are still under debate and unclear. However, the 3D structure of this transporter is unknown and it’s an end goal for elucidating the mechanism of action of the transporter which will allow screening easily more effective drugs. In order to be available to crystalize a membrane protein for its structure, a huge number of initial steps are necessary. First, the protein of interest must be expressed in a recombinant system satisfactorily and, membrane proteins are not easily expressed in all expression systems. Second, human membrane proteins are even harder to express because it’s necessary to work with a non-prokaryote expression system or, otherwise, it is very likely to obtaining in the end a non-functional protein. It has been described, only once, that hSGLT1 could be expressed in a eukaryotic yeast expression system: Pichia pastoris. This yeast has been used a lot in the last 10 years for expressing membrane proteins successfully because, unlike Saccharomyces cerevisae, it can grow much more and therefore obtain more protein in the end. Another advantage is the stability of the expression clones of P. pastoris which eventually leads to a more reproducible result. Although, some disadvantages must be overcome at the same time to have good expression levels like, for example, the clone selection. Because of all of this, the project presented here was initially based on this previous work done in P. pastoris. This thesis is focused on the expression, purification and characterization of hSGLT1 expressed in a yeast heterologous expression system (P.pastoris). Initially, two vectors were design: One expressing hSGLT1 fused to eGFP and another construct without eGFP. The eGFP construct was used to monitorize the protein expression faster and easier which allows optimizing the protein expression by screening for best expression conditions like: induction time, temperature, media and more. Membrane proteins required to be extracted from the membrane in order to purify them and, to do so; a detergent is required. The eGFP fused protein was also used to screen which detergent is more suitable for protein extraction too. Although, both expression product (non-GFP and GFP) were purified and isolated only the WT hSGLT1 was used for further analysis. Despite the difficulties to reproduce what was described before, the protein was eventually subjected to a binding assay. The binding assay was done with an unusual technique which is: voltage-clamp in planar lipid membranes. This technique allowed to measure transport (functionality) of the protein without the need to be incorporated in a liposomes. The main conclusion extracted in this work is that a functional hSGLT1 can be purified which allows a wide number of possibilities in the future like crystallization for elucidating the structure and mechanism of the protein.