Arming Oncolytic Adenoviruses with Transgenes to Engage Stroma Toxicity and Immune Stimulation as a Double Strategy Against Cancer

Abstract

Oncolytic virotherapy with Adenoviruses has regained importance in the past years with the appearance of fresh and promising strategies to deal with tumors. Among the major limitations of this therapy are the immune suppression induced in the tumor microenvironment, which prevents the generation of an antitumor immune response, and the presence of stromal barriers which hinder the viral spread and also contain fibroblasts, cells which are highly resistant to viral replication. In this thesis, both limitations have been addressed in separate chapters. Firstly, aiming to induce immune activation, a panel of viruses expressing, CD200, an immune checkpoint, CD200tr, an N-terminal truncated version of the former with antagonistic effect on its receptor (CD200R), K14, a CD200 homolog from HHV-8, and K14tr, a truncated version of K14 and hence a putative antagonist to CD200R, was generated. Throughout the development of this project, we validated the viability of these viruses, we detected the transgenes in supernatants from infected cultures, we confirmed the inhibitory role of CD200 and K14 and the antagonistic one for CD200tr, but our data did not suggest a similar function for K14tr. As for the second project, we generated oncolytic Adenoviruses expressing bacteria- derived toxins modified in such a way they become activated only stroma-specific proteases, aiming to induce indiscriminate cell death once activated at the target tissue. Alpha-toxin from Clostridium septicum and aerolysin from Aeromonas hydrophyla were the toxins of choice. During the development of this project, we successfully generated and characterized all the viruses, we detected aerolysin in supernatants from infected cultures, we confirmed toxin-mediated cytotoxicity in cultures that expressed the activating proteases, and we performed in vivo studies to evaluate the antitumor efficacy, toxicity and the effects on the stroma of the toxins. Whilst for Alpha-toxin no promising results were obtained, the aerolysin-expressing virus increased oncolytic potency in our models, indicating that it could be considered as a potential clinical candidate in stroma-abundant tumors and encouraging to follow this research pipeline.

La viroteràpia amb Adenovirus oncolítics ha recuperat una embranzida que havia perdut fa anys amb l’aparició de noves estratègies per atacar els tumors. Entre les limitacions més importants que troba aquest tipus de teràpia es troben la immunosupressió induïda en el microambient tumoral, que evita la generació d’una resposta immune antitumoral, i la presència de barreres estromals, que dificulten la dispersió del virus dins el tumor i que conté fibroblasts, cèl·lules molt resistents a la replicació viral. En aquesta tesi s’han adreçat aquests dos problemes en dos capítols diferents. En primer lloc, amb l’objectiu de trobar una manera d’activar les cèl·lules del sistema immune, es va generar una bateria de virus expressant versions solubles de la proteïna humana CD200, un ligand immunoinhibidor; CD200tr, una versió truncada en un domini N- terminal de la primera que té una funció antagonista amb el seu receptor; K14, una proteïna del HHV-8 amb estructura i funció homòlogues a CD200; i K14tr, una versió truncada de K14 que es va testar com a possible antagonista alternatiu a CD200R, el receptor de CD200. En el desenvolupament d’aquest projecte, es va validar la viabilitat d’aquests virus, es va detectar transgen en sobrenedants de cultius infectats, es va confirmar el paper inhibidor de CD200 i K14 i l’antagonista de CD200tr, però no es van trobar indicis que K14tr pogués actuar de la mateixa manera. Quant a al segon projecte, es van generar virus oncolítics expressant toxines bacterianes modificades per activar-se tan sols en presència de proteases específiques de l’estroma tumoral, amb l’objectiu d’induir una mort cel·lular indiscriminada un cop activades al teixit diana. Les toxines escollides van ser l’Alpha-toxin de Clostridium septicum i l’aerolisina d’Aeromonas hydrophyla. Durant el desenvolupament del projecte es van generar i caracteritzar satisfactòriament tots els virus, es va detectar transgen en sobrenedants de cultius infectats, es va confirmar l’activitat citotòxica d’aquestes toxines en cèl·lules que expressaven les proteases a les quals havien estat dirigides, i es van fer estudis in vivo per avaluar l’eficàcia antitumoral, la toxicitat i l’efecte en l’estructura de l’estroma de les esmentades toxines. Mentre que l’Alpha-toxin no va generar resultats prometedors, els resultats obtinguts amb el virus expressant aerolisina obren la porta a considerar-lo com a un candidat clínic en tumors amb alt contingut estromal i a seguir aquesta línia de recerca.