Efectos de la depleción de la histona H1 en células de cáncer de mama: proliferación y respuesta a interferón

Abstract

La histona H1 se une al nucleosoma, situándose en la base, cerca de los sitios de entrada y salida del DNA, siendo una de sus principales funciones descritas, el mantenimiento de una estructura estable y condensada de la cromatina. Los primeros estudios realizados del rol que desempeña H1 en la regulación transcripcional señalaban que H1 era un represor global de la transcripción. Sin embargo, estudios recientes sugieren que H1 desempeña un papel más dinámico y contribuye a una regulación transcripcional específica de genes. Siete variantes de histonas H1 existen en células somáticas humanas (H1.1 a H1.5 que son expresadas de una manera dependiente de la replicación, mientras que H1.0 y H1X son independientes de la replicación). Uno de los principales debates es si dichas variantes de histonas H1 tienen un rol específico o redundante. En este trabajo investigamos esto a través de RNAs interferentes inducibles para inhibir de manera individual y por primera vez de manera simultánea las variantes de la histona H1 en células de cáncer de mama T47D. La inhibición individual de las distintas variantes ocasionó una reducción de la velocidad de crecimiento enc omparación a células parentales. Al inhibir de manera simultánea las variantes H1.2 y H1.4, se observó que la proliferación se ve afectada en mayor medida que al inhibir las variantes H1.2 y H1.4 de manera individual. Debido a que la proliferación celular y adhesión celular son características relacionadas con la tumorogénesis e invasión metastásica, se investigó además los efectos de la depleción de las distintas variantes en la capacidad de formar colonias independientes del anclaje. Nuestros resultados sugieren que la variante H1.2 es esencial para que las células crezcan tanto de manera independiente como dependiente del anclaje, lo que sugiere que al inhibir dicha variante las células posiblemente pierden su capacidad metastásica. La combinación de la depleción de H1.2 y H1.4 indujo una fuerte respuesta a interferón (IFN), efecto que no se observó en depleciones individuales de variantes de histonas H1. Se verificó que la depleción combinada de H1.2 y H1.4 producía la sobreexpresión y síntesis de interferón. Dicha síntesis de IFN indujo la respuesta a IFN en células T47D y activó la ruta JAK-STAT, principal ruta involucrada en la activación de la transcripción de ISGs. Se verificó mediante la combinación de dos RNA interferentes para las variantes H1.4 y H1.2 en T47D(H1.4/H1.2sh) que la respuesta a interferón ocasionada por el multiH1 shRNA, se reproduce al inhibir tanto a nivel de RNA como de proteína únicamente las variantes H1.2 y H1.4. La inhibición de otras combinaciones que incluyen H1.2 con H1.5, H1.4 con H1.5 y triples combinaciones H1.2/H1.5/H1.3 y H1.4/H1.5/H1.3 produjeron, sólo cuando la depleción de H1.2 estuvo involucrada, la sobreexpresión de ISGs a niveles inferiores a los observados en la depleción mH1sh o en la combinación H1.4/H1.2. En las células en las que no se deplecionó H1.2 no se observó la respuesta a interferón. Por otra parte, la combinación de la depleción de H1.2 y H1.4(H1.4/H1.2sh) con el tratamiento con IFNβ comercial produjo un efecto sinérgico en la sobreexpresión de ISGs, lo que sugiere que existen otros mecanismos de inducción de los ISGs además de la estimulación por el IFN sintetizado. Análisis con inhibidores y knock downs constitutivos de sensores y adaptadores de la respuesta a IFN nos sugieren que posiblemente al deplecionar H1.2/H1.4 se desencadena la expresión de dsRNA no codificantes posiblemente formados desde retrovirus endógenos o de secuencias repetitivas de heterocromatina, y que dichos ácidos nucleicos son los causantes de la activación de la respuesta inmune antiviral, que ocasiona los efectos observados como son la síntesis de IFN, sobreexpresión de ISGs, defectos en la proliferación.

Histone H1 binds to linker DNA contributing to higher-order chromatin compaction. In addition, H1 seems to be actively involved in the regulation of nuclear processes such as gene expression control or DNA damage signaling. Seven linker histone H1 variants exist in human somatic cells (H1.1 to H1.5 being expressed in a replication-dependent manner, whereas H1.0 and H1X are replication-independent), with distinct prevalence depending on the cell-type analyzed and along differentiation. It is not well known whether the different variants have specific or redundant roles. We explored this by inducible shRNA- mediated knock-down of each of the H1 variants in breast cancer cells. Knock-down of each H1 variant alters expression of a different reduced subset of genes and affects cell proliferation in a different extent. Although H1.2 is the only variant essential for cells to grow in anchorage-independent conditions, being the H1 that alters the most the proliferative and metastatic properties of cancer cells. Combined depletion of H1.2 and H1.4 has a strong deleterious effect in the cancer cells examined, and induces a strong interferon (IFN) response with up-regulation of many IFN-stimulated genes (ISGs), which is not seen in individual H1 knock-downs. Although H1 participates to repress ISG promoters, its activation upon H1 KD is mainly generated by the activation of the IFN response through cytosolic nucleic acids receptors, IFN synthesis and JAK-STAT pathway activation. The IFN response may be triggered by the expression of noncoding dsRNAs generated from heterochromatic repeats or endogenous retroviruses upon H1 KD. In conclusion, redundant H1-mediated silencing of heterochromatin is important to maintain cell homeostasis and to avoid an unspecific growth-inhibiting IFN response.