Parasitación de Cornu aspersum Müller, 1774 (Helicidae) por metacercarias del género Brachylaima sensu lato Dujardin, 1843 (Brachylaimidae): tratamiento antihelmíntico y consumo humano

Abstract

El caracol de consumo humano Cornu aspersum actúa como hospedador intermediario en el ciclo biológico de Brachylaima spp. albergando metacercarias libres en riñón. Su ingestión insuficientemente cocinados permitiría a las metacercarias originar adultos en el intestino humano causando la braquilaimosis, parasitosis con una mortalidad esperada del 5-10%, con casos humanos en Australia. Los objetivos de esta tesis fueron: determinar la prevalencia de metacercarias Brachylaima spp. en C. aspersum de consumo en mercados españoles; estudiar la dinámica de parasitación considerando la localización geográfica de los caracoles y la estacionalidad como factores de riesgo respecto a la exposición humana al parásito; describir la influencia de la importación de caracoles sobre la dispersión geográfica de Brachylaima spp.; evaluar la eficacia del praziquantel (PZQ) frente a metacercarias Brachylaima spp.; desarrollar un método bioanalítico mediante HPLC-MS/MS para determinar cualitativamente y cuantitativamente PZQ en el gasterópodo y evaluar mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) los efectos ultraestructurales producidos por el PZQ en metacercarias tratadas. Se analizó 3710 ejemplares de C. aspersum durante 5 años en mercados españoles [Barcelona (n=2525), Bilbao (n=207), Madrid (n=290), Tudela (n=301), Valencia (n=163) y Zaragoza (n=224)]. Se examinó individualmente el riñón y se registró la carga de metacercarias. Se calculó la prevalencia global (41’97%;95%IC:40’38%-45’56%), por ciudad y por mercado en el caso de Barcelona y la estacionalidad (↑otoño). El modelo de regresión logística que mide la probabilidad de adquirir caracoles parasitados utilizando la ciudad y la estación como predictores (79% de acierto global), mostró riesgo significativo (p=0.001) en interacciones Tudela-Otoño (4.330-78.584) y Barcelona-Otoño (2.551-38.442). Se determinó la prevalencia de metacercarias en caracoles importados de Argelia y Sudáfrica obteniéndose adultos experimentales cuya aproximación específica se realizó mediante análisis morfométrico comparativo con adultos B. mascomai y B. llobregatensis. Se emplearon 18 variables morfométricas aplicándose MANOVA y Análisis de Componentes Principales, mostrando superposición B. llobregatensis/Adultos argelinos y B. mascomai/Adultos sudafricanos. La eficacia de PZQ frente a metacercarias Brachylaima spp. en C. aspersum se evaluó mediante dos ensayos (VICH GL7): de determinación de la dosis adecuada para conseguir una reducción de la carga parasitaria igual o superior al 90% y de confirmación de dosis. Se administró PZQ a los caracoles vía oral en el pienso de engorde. El método analítico HPLC-MS/MS se desarrolló siguiendo la guía EMEA/CHMP/EWP/192217/2009 de la EMA. En el ensayo de determinación de dosis se testaron tres dosis individualmente (n=300, 10 días): 1’2mgPZQ/caracol, 1’8mgPZQ/caracol (eficacia 97’3 %, p<0.001) y 2’4mgPZQ/caracol (eficacia 98’7%, p<0.001). En el test de confirmación de dosis (n=200) se ensayó 2’4 mg/caracol en grupo (10 caracoles/caja, 7 días) (eficacia 94’6%,p<0.001). La prevalencia disminuyó del 68’7% en el grupo control al 10.1% en el grupo tratamiento, p<0.001. La dosis recibida correspondió a 200’2mgPZQ/kg de caracol con concha. En el método analítico se evaluaron la linealidad rangos 0’05-0’8µg/ml y 0’8-6µg/ml (r2=0’99), el límite de cuantificación inferior (0’05 µg/ml), la selectividad, el efecto de arrastre, la exactitud variaciones nominales inferiores al ±20%,, la precisión manteniéndose en el intervalo de 15-20%, la integridad de la dilución, el efecto matriz (%CV=10’86 y %CV=10’01) y la estabilidad. Se determinó cuantitativamente el residuo de praziquantel (n=60) en caracoles tratados (11mgPZQ/g pienso), siendo de 0’093 mgPZQ/g caracol (10% del PZQ teóricamente ingerido). Los efectos ultraestructurales del praziquantel en metacercarias recuperadas de C. aspersum tratados individualmente (1’2 mgPZQ/caracol y 2’4 mgPZQ/caracol) y en grupo (2’4mgPZQ/caracol ad libitum durante 7 días) mostraron pérdida de la orientación característica de los cuerpos celulares tegumentarios T2 y mitocondrias observada en las metacercarias control, alteración mitocondrial y de los cuerpos celulares tegumentarios T2, ya a nivel de las células tegumentarias. La contracción del sistema digestivo fue tan severa que el lumen no pudo apreciarse.

The edible land snail Cornu aspersum acts as second intermediate host in the cycle of Brachylaima sp. trematode, harboring free metacercariae in its kidney. The ingestion of undercooked infected snails by humans allow metacercariae to develop to adult stage in the intestine causing brachylaimiasis. The aims of this dissertation were: to explore the prevalence of Brachylaima sp. metacercariae in C. aspersum intended for consumption in Spanish marketplaces considering geographical localization and seasonality as risk factors and the potential effect of international snail trade on the parasite dispersion, to assess the efficacy of praziquantel (PZQ) against Brachylaima sp. metacercariae, to develop a bioanalytical method by HPLC-MS/MS to quantify PZQ residue, and to assess ultrastructural changes by transmission electronic microscopy (TEM) of PZQ treated Brachylaima metacercariae. A total of 3,710 C. aspersum specimens were analyzed along 5 years in Spain, the overall prevalence was 41.97% (95%CI: 40.38%-45.56%) with a season effect of increasing prevalence from summer to autumn with a logistic regression model with a correct prediction of 79.0%. Studies conducted on prevalence and viability of metacercariae from snails imported to Spain from Algeria and South Africa provided experimental adult specimens which were measured considering 18 variables. Morphometric studies performed through MANOVA and Principal Component Analysis, revealed univariate effects in 13 variables and an overlap between B. llobregatensis/Algerian adults and B. mascomai/South African adults, respectively. In dose determination assays three doses with snail food were individually tested: 1.2 mg PZQ/snail, 1.8 mg PZQ/snail (efficacy 97.3 %, p<0.001) and 2.4 mg PZQ/snail (efficacy 98.7%, p<0.001). In dose confirmation tests the 2.4 mg PZQ/snail dose was group tested being the efficacy 94.6 %, p<0.001; and the prevalence 10.1 %, p<0.001 from 68.7 %. In the analytical method, linearity, lower limit of quantification (0.05 µg/ml), selectivity, carry over, accuracy, precision, dilution integrity, matrix effect and stability were tested and PZQ determined in 60 treated snails (0.093 mg PZQ/g snail). TEM studies revealed that the characteristic arrangement was lost for mitochondria and the T2 secretory bodies, both also showed degeneration, T2 bodies even in the tegumental cell bodies, and the digestive system displayed a strong contraction.