Tumores del Desarrollo, Epigenética y miRNAs

Abstract

Evidencias recientes han mostrado que los tumores sólidos pediátricos, incluidos el neuroblastoma y el meduloblastoma, albergan una baja cantidad de mutaciones genéticas recurrentes, pero presentan una proporción significativa de alteraciones recurrentes en los mecanismos epigenéticos. Además, la epigenética es un mecanismo regulatorio fundamental durante el desarrollo en mamíferos.

En este proyecto hemos estudiado los cambios epigenéticos que afectan a dos tumores neuronales pediátricos prototípicos, el neuroblastoma y meduloblastoma. Mediante el estudio de los cambios de metilación del ADN, los miRNA y la expresión génica, hemos identificado modificaciones genéticas y epigenéticas que subyacen a la base molecular de la patogénesis y tienen implicación clínica en la evolución de estos tumores neurales. El objetivo principal de nuestro proyecto era identificar marcadores moleculares y posibles dianas de interés para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas.

Este proyecto fue el primer estudio completo de metilación del ADN en neuroblastoma empleando microarrays de alta densidad. Detectamos por primera vez en neuroblastoma la presencia de metilación del ADN en citosinas no-CpG, asociada a tumores de bajo riesgo clínico. El estado de metilación detectado en el contexto no-CpG indica un papel potencial de esta metilación en la diferenciación y regulación transcripcional de genes clave el en desarrollo, como por ejemplo ALK. Observamos que la metilación del ADN en el neuroblastoma afecta no sólo a los promotores, sino también a las regiones intragénicas e intergénicas tanto en sitios CpG como no-CpG en dominios funcionales de la cromatina de genes implicados en desarrollo y cáncer.

Los cambios de metilación del ADN en sitos CpG y no-CpG tanto dentro como fuera de islas CpG (CGI) y localizados en el cuerpo del gen podian estar asociados con el comportamiento clínico del neuroblastoma. Detectamos cambios en contexto no-CpG que sugieren que el neuroblastoma puede ser epigenéticamente diferente a lo largo de la terapia. Además, analizando citosinas fuera de las regiones promotoras, en el cuerpo del gen y de las regiones intergénicas, en sitios CpG asociados a CGI y en sitios no-CpG dentro y fuera de CGIs observamos una asociación de la metilación con el comportamiento clínico en neuroblastoma.

La segunda parte del proyecto se centró en tratar de dar respuesta a la creciente necesidad de aplicar en la práctica clínica el sistema de clasificación del meduloblastoma en los subgrupos moleculares WNT, SHH, Grupo 3 y Grupo 4, recientemente identificados y propuestos mediante análisis (epi)genómicos. El reconocimiento de los subgrupos consenso ha cambiado la forma en que se estudia el meduloblastoma en el contexto de la investigación y cómo se diagnostica y trata en el contexto clínico. Estos subgrupos moleculares se definen actualmente mediante robustos sistemas de clasificación basados técnicas difícilmente incorporables a la rutina clínica de la mayoría de hospitales que tratan tumores cerebrales infantiles.

Hemos desarrollado una metodología clínicamente aplicable, robusta, rápida y reproducible para la predicción exacta de subgrupos de meduloblastoma de muestras individuales en base a dos paneles compuestos por conjuntos reducidos de biomarcadores epigenéticos, y por tanto, potencialmente incorporables en la rutina de diagnóstico. Los biomarcadores epigenéticos identificados podían aplicarse a muestras individuales de ADN de meduloblastoma obtenidas a partir de tejido congelado o FFPE. El patrón bimodal de los paneles permitía el análisis mediante diversas técnicas moleculares, tanto cuantitativas como cualitativas. Nuestro enfoque era técnicamente más simple, rápido y coste efectivo en comparación con las actuales técnicas estándar de clasificación de subgrupos de meduloblastoma.

Recent evidence has shown that pediatric solid tumors harbor a paucity of recurrent genetic mutations as compared to other tumors from adults, suggesting that additional mechanisms such as epigenetic alterations may play an important role in the molecular pathogenesis of developmental tumors.

So far the great majority of studies that have investigated DNA methylation in developmental tumors were biased towards CpG sites and promoter regions. Recent genome- wide studies are starting to reveal a role for DNA methylation outside such genomic contexts. Furthermore, it has recently been described that cytosine methylation also occurs in sites other than CpG dinucleotides (mCHG and mCHH) in embryonic stem cells and during brain development. However, DNA methylation at non-CpG contexts has rarely been described in cancer.

We have analyzed the DNA methylome of two prototypical developmental neural tumors, neuroblastoma and medulloblastoma, using high-density microarrays with the aim of detecting epigenetic modifications at a genome-wide level that may have clinical relevance in the pathogenesis of these pediatric tumors, to identify molecular markers and potential targets of interest for the development of new therapeutic strategies.

Our DNA methylation studies in neuroblastoma using high-density microarrays have defined the epigenetic landscape of this pediatric tumor and its potential clinicopathological impact. Our results reveal that:

- DNA methylation changes in neuroblastoma affect not only promoters but also intragenic and intergenic regions at CpG sites and, for the first time in neuroblastoma, at non-CpG sites. - These epigenetic changes show a non-random distribution relative to functional chromatin states, and frequently target development and cancer-related genes relevant for neuroblastoma, such as CCND1 and ALK. - DNA methylation patterns in non-CpG sites provide new insights into the differentiation stage of high and low-risk neuroblastomas. - DNA methylation changes at CpG and non-CpG sites are strongly associated with clinicopathological features of neuroblastoma and with patient outcome.

Furthermore, we have developed a simplified and reproducible approach to classify medulloblastoma tumors into clinically relevant subgroups applying epigenetic markers. Using this strategy, MB patients can be accurately classified into the three consensus subgroups WNT, SHH and non-WNT/non-SHH. In addition, we propose a similar approach for the specific classification of Group 3 and Group 4 medulloblastoma tumors. The proposed strategies allows for classification of single DNA samples from biopsies both frozen as well as FFPE of primary, metastasis or relapse compartments, using diverse molecular approaches. Our results show that the proposed strategy is robust, accurate, and cost-effective, making it adequate for molecular subgrouping of medulloblastoma in daily diagnostic practice of most centers treating children with brain tumors.