Role of HDAC11 in muscle cell differentiation and regeneration = Paper de HDAC11 en la diferenciació i regeneració musculars

Abstract

HDAC11 is the newest member of the histone deacetylase (HDAC) family and one of the less studied. Its expression was described to be enriched in skeletal muscle tissues from the first moment of its discovery, yet now after 15 years, its roles in myogenesis remain unknown. We started this thesis by analyzing the expression changes of all HDAC’s’ members between proliferation and early differentiation conditions, which constitutes a crucial cell fate point in which cells have to decide whether to continue proliferating or enter to irreversible G0 arrest state to differentiate. With this analysis, we found HDAC11 as the HDAC family member the most upregulated in the skeletal muscle differentiation process. By CRISPR/Cas9 knock-in tagging of endogenous HDAC11, we show that HDAC11 protein levels are absent in proliferating cells and increased through differentiation. The silencing of HDAC11 in proliferation conditions is mediated, at least in part, by class I HDAC’s deacetylation of MYOD. In differentiation conditions, acetylated MYOD and myogenin, the two master regulators of muscle differentiation, bind to HDAC11 promoter regions and trigger its expression. HDAC11 deficient myoblasts did not present major alterations in cell proliferation or differentiation capacities but show reduced fusion ability. Genome-wide transcriptomic analysis of differentiating HDAC11 deficient myoblasts revealed an upregulation of genes involved in proliferation and a decreased expression of genes involved in muscle contraction, suggesting a delayed entry in G0 irreversible arrest state. Our ChIP results suggest that HDAC11 would mediate repression of proliferation related genes by deacetylation of H3 in their promoter regions. Moreover, HDAC11 expression is also highly expressed in additional G0 states, like in reversible arrested quiescent satellite cells. In skeletal muscle tissues, HDAC11 is higher expressed in fast muscles than slow ones, especially in males. The analysis of HDAC11 deficient mice concludes that HDAC11 absence do not cause major alterations in muscle development, adult myofiber growth or fiber type composition in basal conditions. In regeneration conditions, HDAC11 deficient mice show advanced regeneration capacity at 7 days post injury, probably mediated at least in part, by an increased expression of Il-10 by HDAC11 deficient macrophages. Finally, we show that HDAC11 upregulation through differentiation is conserved in human myoblast and its expression is reduced in rhabdomyosarcoma cells, which present impaired differentiation capabilities. Altogether, our results place HDAC11 as a new epigenetic regulator in in vitro an in vivo myogenesis.

HDAC11 és el membre més recentment descobert de la família de deacetilases d'histones (HDAC) i un dels menys estudiats. En el moment del seu descobriment es va veure que estava altament expressada en teixits de múscul esquelètic encara que després de 15 anys, les seves funcions en la miogènesi resten encara desconegudes. Vam començar aquesta tesi analitzant els canvis d'expressió de tots els membres de la família HDAC entre les condicions de proliferació i diferenciació primerenca, un moment crucial on les cèl·lules han de decidir si continuen dividint-se o entren en l'estat d'aturada irreversible G0 per diferenciar-se. Amb aquesta anàlisi vam trobar HDAC11 com el membre de la família HDAC que augmentava més la seva expressió en aquest procés. Amb la tècnica d'enginyeria genètica CRISPR/Cas9 vam aconseguir inserir un epítop en el locus genòmic de HDAC11, que ens permeté demostrar que la proteïna HDAC11 està absent en condicions de proliferació i augmenta amb la diferenciació. El silenciament de l'expressió de HDAC11 durant la proliferació està mitjançada, almenys en part, per la deacetilació de MYOD per part de la classe I de HDACs. Durant la diferenciació, MYOD acetilat i miogenina, els dos reguladors responsables d’iniciar la diferenciació muscular, s'uneixen al promotor de HDAC11 i activen la seva expressió. Els mioblasts deficients en HDAC11 no presenten greus alteracions en la proliferació cel·lular o en la seva capacitat de diferenciar-se però mostren una reduïda capacitat de fusió. L'estudi transcriptòmic a escala global de mioblasts deficients en HDAC11 va revelar una sobreexpressió de gens involucrats en la proliferació cel·lular i una reducció en l'expressió de gens amb funcions en la contracció muscular, suggerint una entrada més tardana en la fase G0 d'aturada irreversible. Els nostres resultats de ChIP suggereixen que HDAC11 podria intervindre en la repressió dels gens involucrats en la proliferació cel·lular mitjançant la deacetilació de les histones H3 dels seus promotors. A més, l'expressió d'HDAC11 també és alta en estats addicionals de G0 com l'arrest reversible de les cèl·lules satèl·lit quiescents. En teixits de múscul esquelètic, HDAC11 està més expressada en músculs ràpids que lents, especialment en mascles. L'anàlisi de ratolins deficients en HDAC11 conclogué que l'absència de HDAC11 no causa greus alteracions en el desenvolupament muscular, el creixement de miofibres adultes o en la composició en tipus de fibres en condicions basals. Durant la regeneració muscular, els ratolins deficients en HDAC11 mostren un avanç en la seva capacitat de regeneració 7 dies després de la lesió, probablement mitjançat en part per un increment en l’expressió de Il-10 per part dels macròfags deficients en HDAC11. Finalment, mostrem que l’augment d’expressió de HDAC11 està conservat en la diferenciació de mioblasts humans i que la seva expressió està reduïda en rabdomiosarcoma, patologia tumoral que presenta un impediment en la diferenciació muscular. En conjunt, els nostres resultats situen HDAC11 com un nou regulador epigenètic en la miogènesi in vitro i in vivo.