Exosomes in uterine aspirates: characterization and identification of diagnostic and prognostic biomarkers in endometrial cancer

Abstract

El càncer d’endometri (CE) és la malaltia del tracte genital femení més freqüent als EE.UU i ocupa la quarta posició del rànquing de càncers més comuns en dones. Malauradament, les morts per CE estan augmentant ràpidament i les taxes van incrementar un 2% anual del 2010 al 2014. Tot i que els tumors confinats dins l’úter i diagnosticats precoçment representen un 67% dels casos i presenten un supervivència als 5 anys d’un 95%, resta un 30% dels casos diagnosticats en estadis avançats de la malaltia que presenten una davallada dràstica en la taxa de supervivència a 5 anys (69% i 17% pels casos amb disseminació regional i distant, respectivament). El CE es pot dividir en tipus 1 (el més comú i dependent d’estrògens) i tipus 2 (menys comú però més agressiu i independent d’estrògens). Hi ha una necessitat clara de desenvolupar un test no invasiu capaç de detectar els casos de CE de manera precoç i que pugui discriminar entre els subtipus. El procés diagnòstic actual es tediós i inclou un examen pèlvic i una ultrasonografia transvaginal, seguida de l’examen histopatològic d’una biòpsia endometrial, obtinguda per aspiració o per histerescopia. Per la millora del diagnòstic del CE, l’ús dels aspirats uterins (AUs) reuneix un seguit de característiques que fan d’aquest biofluid una prometedora font de biomarcadors pel cribat, diagnòstic i monitorització de patologies relacionades amb els tracte genital: (i) el mostreig és mínimament invasiu i es poden obtenir entre 50-1000 µl de mostra d’una pacient, material suficient per estudis moleculars; (ii) els AUs estan en contacte directe amb la cavitat uterina i representen el seu ambient complex. La composició dels AUs deriva de secrecions i cèl·lules descamades dels diferents teixits circumdants, de l’epiteli luminal i de les glàndules i de proteïnes transsudades selectivament de la sang; i (iii) els AUs exhibeixen les alteracions moleculars del CE i són útils per estudiar la heterogeneïtat tumoral. Els AUs contenen proteïnes abundants provinents del plasma, que emmascaren la detecció i l’anàlisi de les proteïnes menys abundants, que són generalment els candidats més prometedors. Per solucionar el problema de rang dinàmic i per ampliar la recerca en el camp de nous biomarcadors en CE, els exosomes (exosome-like vesicles, ELVs), que són vesícules de mida nanomètrica alliberades pels cosos multivesiculars i que es fusionen amb la membrana plasmàtica per ser secretats, sorgeixen com un repositori de biomarcadors. Aquest estudi se centra en la identificació de marcadors proteics en ELVs aïllats de AUs. Els extractes proteics es van obtenir de ELVs obtinguts per ultracentrifugació diferencial dels AUs de 3 grups de pacients: control, CE tipus 1 i CE tipus 2 (10 pacients/grup). La qualitat dels ELVs es va comprovar per Nanoparticle tracking Analysis i immunoblots. Per comparar l’abundància de proteïnes entre els 3 grups, vàrem utilitzar la tècnica del Super-SILAC, on els ELVs aïllats de 3 línies de CE cultivades en medi amb marcatge pesat (Lys i Arg) es van combinar amb les proteïnes sense marcatge dels ELVs de cada pacient per tenir un estàndard intern. Les mostres es van separar electroforèticament i les bandes tallades es van digerir en-gel amb tripsina per ser analitzades per LC-MS/MS. Várem generar una llista de 54 candidats que es van analitzar per LC-SRM en una cohort independent de 107 pacients dividits en 3 grups: control(n=41), CE tipus 1 (n=45) i CE tipus 2 (n=21). L’estudi de proteòmica dirigida va confirmar que els ELVs dels AUs contenen proteïnes que poden discriminar entre pacients amb càncer i controls. Cal destacar que es va trobar un panell de 2 proteïnes que incrementa la capacitat de discriminació, i que és independent del tipus de càncer (ROC AUC=0.94). A més a més, també es va trobar un panell amb poder per discriminar entre tipus 1 i tipus 2 (ROC AUC=0.93). Aquest estudi presenta implicacions importants en la detecció primerenca de CE i en l'estratificació dels pacient.

Endometrial cancer (EC) is the most common cancer of the female genital tract and the fourth most frequent cancer in women in the United States. Discouraging, EC deaths are increasing rapidly and rates grew about a 2% per year from 2010 to 2014. Even though early-stage diagnosed EC restricted to the uterus represent 67% of the cases with a 5-year survival rate of 95%, it still remains around a 30% of patients diagnosed at advanced stages of the disease, when the 5-year survival rate decreases dramatically to 69% and 17% in case of regional and distant spreading, respectively. EC is divided into the more common estrogen dependent type 1 and the less common but more aggressive estrogen independent type 2. There is an urgent need to develop non-invasive tests that can provide early detection of EC and that can discriminate EC subtypes. The current diagnostic process is laborious and includes a pelvic examination and a transvaginal ultrasonography followed by a confirmatory histopathological evaluation of an endometrial biopsy, which can either be obtained by aspiration or by hysteroscopy. To improve EC diagnosis, the use of uterine aspirates (UAs) meet some features that makes this biofluid a promising source of biomarkers for screening, diagnosis and monitoring of pathologies related to the female genital tract: (i) sampling of UAs is minimally invasive and it is feasible to retrieve between 50-1000 µl of sample from a patient, which is sufficient to extract material for molecular studies; (ii) UAs are in direct contact with the uterine cavity, representing faithfully its complex environment. UA’s composition derives from secretions and cells flaking from a variety of surrounding tissues, from the luminal epithelium and glands, from proteins selectively transudated from blood, and likely contributors from tubal fluid; and (iii) UAs exhibit molecular alterations present in EC and are useful to study the EC tumor heterogeneity. UAs highly express abundant proteins coming from plasma; and those mask the detection and analysis of less abundant proteins, which are generally the most promising candidates for biomarkers discovery. To solve this dynamic-range problem, and to expand research in the field of biomarkers discovery for EC, exosome-like vesicles (ELVs), nanosized-membranous vesicles released by multivesicular bodies fusing with the cell membrane, arise as a promising source of EC biomarkers. This study focuses on the identification of protein markers in ELVs isolated from uterine aspirates. Protein extracts from purified ELVs were obtained following ultracentrifugation of UAs from age-matched groups of control, type1 and type2 EC patients (10 patients/group). The quality of isolated ELVs was monitored by Nanoparticle Tracking Analysis, and immunoblots. To profile protein abundance across different groups, we develop a super-SILAC approach where ELV proteins from 3 different EC cell lines grown in heavy Lys and Arg amino acids were combined with ELV protein extracts of each patient. Proteins were separated by SDS-PAGE and gel-isolated bands were digested with trypsin and analyzed by Mass Spectrometry. We generated a list of 54 protein candidates that was further validated by LC-SRM in an independent cohort of 107 patients including 3 age-matched groups: type 1 EC (n=45) EC, type 2 EC (n=21) and healthy individuals (n=41). Our targeted mass spectrometry approach confirmed that ELVs from UAs contain proteins that can discriminate between cancer and healthy patients. More importantly, a 2-protein signature improves this capacity to discriminate healthy from EC patients (ROC AUC=0.94). This protein signature can detect endometrial cancer independently of the cancer type. In addition, we also report a new protein signature that can differentiate type1 versus type2 EC (ROC AUC=0.93). This study has important implications in early detection of EC and in patient stratification.