Myosin VB in intestinal pathogenesis

Abstract

Miosina VB es una proteína que actúa como un motor molecular usando la energía del ATP para moverse a lo largo de filamentos de actina. Participa en el trafico intracelular de endosomas de reciclaje en la parte subapical de células polarizadas y no polarizadas. Su expresión es muy abundante en el intestino donde participa en el establecimiento y mantenimiento de la polaridad de los enterocitos. Mutaciones en MYO5B causan la enfermedad de inclusión de microvellosidades, in raro trastorno congénito que afecta a las células epiteliales del intestino cursando con diarrea acuosa persistente que suele ser fatal. Esta enfermedad se caracteriza por la presencia de alteraciones morfológicas en los enterocitos, atrofia de las vellosidades y deslocalización de proteínas del polo apical y basolateral del enterocito. Su patología molecular no se conoce, principalmente por la falta de modelos animales. En el presente estudio, describimos un versátil modelo murino con inactivación constitutiva de Myo5b e inactivación condicional en las células epiteliales intestinales inducida por tamoxifeno. En ambos casos, los animales muestras un cuadro clínico muy semejantes al de los pacientes con enfermedad de inclusión de microvellosidades, presentado diarrea y deshidratación que causan la muerte del animal. A nivel histológico, el intestino muestra las mismas alteraciones en los enterocitos que las presentes en pacientes humanos, incluyendo atrofia de vellosidades y deslocalización de marcadores proteicos. Además, la inactivación de Myo5b también provocó hiperproliferación de las criptas intestinales. Por lo tanto, el modelo animal presentado constituye una herramienta muy útil para investigar las causas moleculares de la enfermedad y ensayar de manera preclínica fármacos u otras opciones terapéuticas. Por otro lado, la pérdida de polaridad y diferenciación es también una de las señas de identidad de los carcinomas metastásicos avanzados y correlaciona con un mal pronóstico de los pacientes. En concreto, para el cáncer colorrectal, investigaciones previas llevadas a cabo en nuestro laboratorio ya han demostrado que la pérdida de miosina IA promueve la progresión la enfermedad y tiene actividad supresora de tumores. Dicha proteína es abundante en el borde en cepillo de los enterocitos, y participa en el mantenimiento de la estructura polarizada. Otros estudios han señalado la relación entre la inactivación de MYO5B con un incremento en la motilidad e invasión de células de cáncer gástrico, aunque todavía no se conoce nada de su relación con en el cáncer colorrectal. Para resolver esta cuestión, hemos diseñado modelos in vitro inducibles por doxiciclina para sobre expresar y reducir la expresión de dicha proteína en líneas celulares de cáncer de colon. Además, se ha empleado la tecnología CRISPR/Cas9 para inactivar la expresión de MYO5B en la línea de cáncer de colon Caco2-BBE. Los resultados muestran cambios en la polarización y diferenciación de dichas líneas celulares, de acuerdo con observaciones previas. También se ha observado una posible relación entre MYO5B y la capacidad de movilidad e invasión de las líneas de cáncer de colon. Sin embargo, la hiperproliferación observada en el intestino de los ratones no se reproduce en las líneas de cáncer de colon empleadas tras reducir o sobre expresar MYO5B, o en modelos xenograft subcutáneos in vivo de dichas líneas. Por otro lado, usando un microarray de tejidos con 155 muestras de tumores primarios de pacientes con cáncer colorrectal en estadio Dukes C se ha comprobado que una reducción en la expresión de MYO5B se asocia con una disminución en el tiempo de recaída y en la supervivencia total de los pacientes de cáncer de colon. Además, tumores con un grado de diferenciación bajo también expresan niveles de MYO5B significativamente reducidos. Finalmente, todos estos resultados indican que MYO5B juega un papel importante en la diferenciación del intestino normal y de las líneas de cáncer de colon. De la misma manera, MYO5B también podría desempeñar un papel en la progresión del cáncer colorrectal promoviendo movilidad e invasión de las células tumorales.

Myosin VB is a molecular motor protein that uses the energy of ATP to move along actin filaments. It participates in the recycling endosomes trafficking in the subapical cytoplasmic region of non-polarized and polarized cells. It is highly expressed in the small and large intestine, where its role in the establishment of polarized function in enterocytes is also well known. Inactivating mutations of MYO5B have been associated with microvillus inclusion disease (MVID), a rare congenital disorder of the intestinal epithelial cells that presents with persistent life-threatening watery diarrhea. It is characterized by morphological enterocyte abnormalities such as microvillus atrophy and mislocalization of apical and basolateral protein transporters. The molecular pathology of the disease is not well known mainly due to the lack of animal models. In the present study, we report a versatile murine model with targeted inactivation of Myo5b. This model allowed us to generate and characterized a constitutive Myo5b knockout mice and a tamoxifen-inducible intestinal-epithelium-specific Myo5b knockout. In both cases, the mice closely resemble the phenotype of MVID patients, developing watery diarrhea and dehydration causing the death of the animal. Histological study of the intestine showed all the characteristic enterocyte defects observed in MVID patients, including microvillus atrophy and mislocalization of protein markers. Moreover, the inactivation of MYO5B also originated hyperproliferation of the intestinal crypts. Therefore, our mice constitute a useful model to further investigate the underlying molecular mechanism of this disease and to preclinically assess the efficacy of novel therapeutic approaches. In addition, hyperproliferation as well as loss of cell polarity, differentiation, and tissue architecture are hallmarks of advanced metastatic carcinomas and strongly correlate with poor patient prognosis. Specifically, for colorectal cancer, the third most common type of cancer worldwide, we have previously demonstrated that the loss of brush border MYO1A, also involved in cell polarity, promotes cancer progression and has tumor suppressor activity. Other studies have indicated a relationship between MYO5B inactivation and gastric cancer, promoting invasion and motility, but little is known regarding its role in colorectal cancer. To address this question, we have developed novel doxycycline-inducible in vitro models of MYO5B overexpression and downregulation. Moreover, we have generated MYO5B knockout Caco2-BBE cells using CRISPR/Cas9 technology. Our results showed changes in the polarization and differentiation of colon cancer cells, in agreement with previous observations in the normal intestine. Moreover, we have observed a relationship between MYO5B and the motility and invasion capacity of colon cancer cells, indicating a possible role of MYO5B in colon cancer progression. However, the effect of MYO5B loss in cell proliferation observed in our Myo5b knockout mice could not be confirmed in our models in vitro and in vivo, employing cell line-derived xenografts. In addition, using a tissue microarray containing triplicate samples from 155 primary Dukes C colorectal tumors, reduced MYO5B expression was found to be associated with shorter disease-free and overall survival of the patients. Moreover, poorly differentiated tumors showed significantly reduced expression of MYO5B. Collectively, our results indicate that MYO5B plays an important role in the differentiation of the normal intestinal epithelium and colon cancer cells, as well as a possible role in cancer progression promoting cell motility and invasion.