Optimizing vitrification of in vitro matured bovine oocytes

Abstract

La gran quantitat de beneficis que ofereix la crioconservació d’oòcits bovins ha incrementat dràsticament la demanda d’oòcits bovins. En aquest context, la crioconservació exitosa d’oòcits bovins madurats in vitro resulta de vital importància per garantir l’abastiment d’oòcits bovins. No obstant això, encara no s’ha aconseguit un protocol de vitrificació d’oòcits bovins eficient i eficaç. L’objectiu d’aquesta tesis és, per tant, investigar la utilització d’elevades concentracions de NaCl o sucrosa abans de la vitrificació i escalfament, l’enriquiment de l’oolema amb colesterol abans de la vitrificació i l’addició d’un biopolímer sintetitzat per un bacteri de l’ Antàrctica durant la vitrificació i escalfament, com a estratègies per millorar els protocols de vitrificació d’oòcits.

S’ha descrit que l’exposició dels oòcits a concentracions elevades de clorur sòdic, sucrosa i trehalosa abans de la manipulació millora la criotolerància a la vitrificació i la capacitat de desenvolupament en l’espècie porcina. En el capítol IV d’aquesta tesis vam observar que el tractament amb solucions de 375 mOsmol de NaCl o sucrosa durant una hora abans de la vitrificació, no tenia efectes perjudicials per l’estat del fus meiòtic dels oòcits bovins madurats in vitro. Concretament, el pretractament amb sucrosa abans de la vitrificació no va ser capaç de millorar el desenvolupament embrionari com s’havia observat en altres espècies.

L’enriquiment de la membrana amb colesterol podria incrementar la fluïdesa i la permeabilitat de la membrana i augmentar la criotolerància dels oòcits a la crioconservació. En el capítol V d’aquesta tesis vam utilitzar bodipy-colesterol per visualitzar el transport del colesterol per microscòpia confocal en oòcits bovins madurats in vitro. Aquest mètode ens va permetre determinar el temps d’incubació necessari per una incorporació òptima del colesterol a la membrana i evitar la no desitjada penetració al citoplasma, utilitzant diferents concentracions de metil-β-cyclodextrines carregades amb colesterol. Tot i que no es va aconseguir millorar la criotolerància en termes de supervivència i capacitat de desenvolupament, l’addició de colesterol alterava l’expressió de gens relacionats amb el metabolisme lipídic, (CYP51), apoptosis (BAX) i metilació del DNA (DNMT3A) en mòrules bovines, sobretot quan els oòcits eren vitrificats a estadi de vesícula germinal. Pseudomonas sp. ID1, un bacteri aïllat del sediment marí de l’Antàrtica, produeix un polisacàrid com a mecanisme de tolerància al refredament (M1 EPS). Aquest exopolisacàrid també confereix crioprotecció per altres cèl·lules bacterianes, suggerint que pot ser utilitzat com a agent per la crioconservació cel·lular. En el capítol VI es va afegir M1 EPS a les solucions de vitrificació i escalfament com a agent bloquejant de la formació de gel, per limitar el dany dels oòcits bovins madurats in vitro i incrementar posteriorment la capacitat de desenvolupament. Es van analitzar els efectes de la suplementació amb diferents concentracions de M1 EPS en l’organització dels fusos meiòtics, la capacitat de desenvolupament en termes de percentatges de blastocists i l’expressió gènica en blastocists de dia 8. La suplementació amb M1 EPS durant la vitrificació i escalfament dels oòcits de vedella prepúber madurats in vitro protegia el fus meiòtic contra la descondensació de cromosomes i microtúbuls causada per la vitrificació. Tot i que després del suplement amb M1 EPS no es va observar millora en els percentatges de blastocists, es van registrar diferents canvis en l’expressió d’alguns gens relacionats amb epigenètica (DNMT3A i KAT2A) i qualitat embrionària (BAX, BCL2) entre blastocists obtinguts a partir d’oòcits vitrificats amb diferents concentracions de M1 EPS. En resum, basant-nos en els resultats d’aquesta tesis, podem concloure que la criotolerància dels oòcits bovins madurats in vitro no només depèn del dany que pateixin en l’organització del fus meiòtic. Sinó que també en els canvis en l’expressió gènica que condicionen el posterior desenvolupament embrionari.

La gran cantidad de beneficios que ofrece la crioconservación de ovocitos bovinos ha incrementado drásticamente la demanda de ovocitos. En este contexto, la crioconservación exitosa de ovocitos madurados in vitro resulta de vital importancia para garantizar el abastecimiento de ovocitos bovinos. Sin embargo, aún no se ha logrado un protocolo de vitrificación de ovocitos bovinos eficiente y eficaz. El objetivo de esta tesis es, por tanto, investigar la utilización de elevadas concentraciones de NaCl o sacarosa antes de la vitrificación y calentamiento, el enriquecimiento del oolema con colesterol antes de la vitrificación y la adición de un biopolímero sintetizado por una bacteria de la Antárctica durante la vitrificación y el calentamiento, como estrategias para mejorar los protocolos de vitrificación de ovocitos.

Se ha descrito que la exposición de los ovocitos a concentraciones elevadas de cloruro sódico, sacarosa y trehalosa antes de la manipulación mejora la criotolerància a la vitrificación y la capacidad de desarrollo en la especie porcina. En el capítulo IV de esta tesis observamos que el tratamiento con soluciones de 375 mOsmol de NaCl o sucrosa durante una hora antes de la vitrificación, no tenía efectos perjudiciales para el huso meiótico de los ovocitos bovinos madurados in vitro. Concretamente, el pretratamiento con sacarosa antes de la vitrificación no fue capaz de mejorar el desarrollo embrionario como se había observado en otras especies.

El enriquecimiento de la membrana con colesterol podría incrementar la fluidez y la permeabilidad de la membrana y aumentar la criotolerància de los ovocitos a la crioconservación. En el capítulo V de esta tesis utilizamos bodipy-colesterol para visualizar el transporte del colesterol por microscopía confocal en ovocitos bovinos madurados in vitro. Este método nos permitió determinar el tiempo de incubación necesario para una incorporación óptima del colesterol en la membrana y evitar la no deseada penetración en el citoplasma, utilizando diferentes concentraciones de metil-β-cyclodextrinas cargadas con colesterol. Aunque no se mejoró la criotoleráncia en términos de supervivencia y capacidad de desarrollo, la addición de colesterol alterava la expresión de genes relacionados con el metabolismo lipídico, (CYP51), apoptosis (BAX) y metilación del DNA (DNMT3A) en mórula bovinas, sobre todo en ovocitos vitrificados en estadio de vesícula germinal. Pseudomonas sp. ID1, una bacteria aislada del sedimento marino de la Antártica, produce un polisacárido como mecanismo de tolerancia al enfriamiento (M1 EPS). Este exopolisacárido también confiere crioprotección a otras células bacterianas, sugiriendo que puede ser utilizado como agente para la crioconservación celular. En el capítulo VI de esta tesis, se añadió M1 EPS a las soluciones de vitrificación y calentamiento como agente bloqueante de la formación de hielo, para limitar el daño de los ovocitos bovinos madurados in vitro e incrementar posteriormente la capacidad de desarrollo. La suplementación con M1 EPS durante la vitrificación y el calentamiento de los ovocitos de ternera prepúber madurados in vitro protegía el huso meiótico contra la descondensación de cromosomas y microtúbulos causada por la vitrificación. Aunque después del suplemento con M1 EPS no se observó mejora en los porcentajes de blastocistos, se registraron diferentes cambios en la expresión de algunos genes relacionados con epigenética (DNMT3A y KAT2) y calidad embrionaria (BAX, Bcl2) entre blastocistos obtenidos a partir de ovocitos vitrificados con diferentes concentraciones de M1 EPS.

En resumen, basándonos en los resultados de esta tesis, podemos concluir que la criotoleráncia los ovocitos bovinos madurados in vitro no sólo depende del daño que sufran en la organización del huso meiótico. Sino que también en los cambios en la expresión génica que condicionan el posterior desarrollo embrionario.

The numerous benefits of bovine oocyte cryopreservation has dramatically increased the demand of bovine oocytes. In this context, successful preservation of in vitro matured bovine oocytes appears to be critical for guarantee the oocyte supply. In spite of that, an efficient and efficacious vitrification protocol for in vitro matued oocytes should be achieved soon. The purpose of this thesis is, therefore, to investigate the use of high concentrations of NaCl or sucrose prior to vitrification/warming, the oolema enrichment with cholesterol prior to vitrification and the addition of an ice bocking biopolymer synthetized by a bacteria from Antarctica during vitrification and warming, as strategies to improve bovine oocyte vitrification protocols. Exposure of oocytes to increased concentrations of sodium chloride, sucrose or trehalose prior to manipulation has been reported to improve both cryotolerance to vitrification and developmental competence in porcine specie. In the chapter IV of this thesis we observed that treatment with 375 mOsmol NaCl or sucrose solution for 1 h before vitrification had no detrimental effects on the meiotic spindle status of IVM bovine oocytes. In particular, sucrose pretreatment prior to vitrification was unable to improve embryo development as observed in other species. Membrane cholesterol enrichment could increase the fluidity and permeability of the membrane and increase the cryotolerance of oocytes to cryopreservation. In chapter V of this thesis we used bodipy-cholesterol to image the cholesterol transport in live in vitro matured bovine oocytes incubated with cholesterol-loaded methyl-β-cyclodextrin by confocal microscopy. This method allowed us to determine the incubation time required for optimal cholesterol incorporation into membrane avoiding the non-desired penetration into cytoplasm, using different cholesterol-loaded methyl-β-cyclodextrin concentrations in different supplemented media. However, cryotolerance in terms of survival and developmental competence was not improved, regardless of the application of the determined cholesterol-loaded methyl-β-cyclodextrin treatment or the holding medium used. However, the cholesterol addition before vitrification, altered the expression of genes related to lipid metabolism (CYP51), apoptosis (BAX) and DNA methylation (DNMT3A) in bovine morulae, mainly when oocytes were vitrified at germinal vesicle stage. Pseudomonas sp. ID1, a bacterium isolated from marine sediment from Antarctica, produces an exopolysaccharide as a cold adaptation mechanism (M1 EPS). This exopolysaccharide conferred cryoprotection for other bacteria cells, suggesting it can thus be applied as an agent for cell cryopreservation. In the Chapter VI the M1 EPS was added to vitrification and warming solutions as an ice blocking agent to limit the in vitro matured bovine oocyte damage and to increase further developmental competence. The effects of different concentrations of M1 EPS supplementation were examined on meiotic spindle organization, developmental competence in terms of blastocyst rates, and gene expression in day 8 bastocyts. M1 EPS supplementation during vitrification and warming of in vitro matured prepubertal heifer oocytes protected the meiotic spindle against chromosome and microtubule decondensation caused by vitrification. Although no improvement on blastocyst rates were observed after EPS supplementation, different changes in gene expression of some gens related with epigenetics (DNMT3A and KAT2A) and blastocyst quality (BAX, BCL2) were recorded between blastocysts derived from oocytes vitrified with different concentrations of M1 EPS. In summary, on the basis of the results of the present Thesis, we can conclude that in vitro matured oocyte cryotolerance does not only depend on the damage on the meiotic spindle organization, but also on the gene expression changes that determine further embryonic development.