Estudio de metilación en los genes CDH1, P15, P16 y BIK en pacientes afectos de mieloma múltiple

Abstract

El Mieloma Múltiple (MM) es una neoplasia hematológica, que en la gran mayoría de casos, la enfermedad viene precedida de una alteración de células plasmáticas (CP) asintomática, la Gammapatía monoclonal de significado incierto (GMSI). Así mismo se ha descrito un estadio intermedio entre GMSI y MM denominado Smoldering Multiple Myeloma (SMM). Se desconoce por qué solo algunas GMSI progresan a MM. Se han elaborado guías de estratificación de los pacientes con marcadores de progresión clínico-biológicos, como los niveles de componente monoclonal, el tipo de cadenas ligeras libres y el porcentaje y atipias de las CP. Sin embargo, y debido a la gran heterogeneidad que presenta esta enfermedad, no existen marcadores de progresión fiables. La inactivación por metilación de los promotores de genes supresores de tumor podría estar implicada en la progresión y/o evolución de la enfermedad. Estudios de metilación global en MM de la literatura describen un aumento del porcentaje de pacientes con metilación, en algunos de estos genes a lo largo de la evolución de la enfermedad. El estudio del patrón de metilación de determinados genes supresores de tumor podría ayudar a comprender los mecanismos implicados en la evolución del MM. En el presente estudio se ha analizado la presencia de metilación en el promotor de los genes supresores de tumor CDH1, P15, P16 y BIK en una serie de 103 pacientes afectos de MM, GMSI o SMM. El análisis de metilación se ha realizado mediante MS-PCR con DNA obtenido del cultivo celular de médula ósea tras fijación con Carnoy, siendo el primero en MM que utiliza este tipo de muestras. Se ha establecido la frecuencia de casos con metilación en estadios asintomáticos y en MM. Se ha comparado la frecuencia de metilación en pacientes con MM estudiados al diagnóstico con la de pacientes estudiados durante el seguimiento y resistentes al tratamiento o en recaída. Asimismo se ha evaluado la posible relación entre la metilación de estos genes y variables clínico-biológicas para establecer su posible valor pronóstico. Las frecuencias de casos con metilación en P15 y P16 mostraron diferencias significativas entre estadios premalignos y MM. Es de destacar que en cuatro de los pacientes, de los que se disponían muestras en dos estadios diferentes de la enfermedad, se observó metilación en BIK únicamente en aquellas correspondientes a la enfermedad resistente a tratamiento. Ello sugiere que la metilación de algunos genes supresores de tumor podría tener un papel importante en la progresión de determinados clones de CP resistentes a tratamiento. Al analizar la relación entre las variables clínico-biológicas y metilación, solamente se encontró correlación en toda la cohorte de pacientes (pre-MM y MM) entre metilación en P15 y niveles elevados de LDH así como entre P16 y niveles elevados de b2-microglobulina y porcentaje elevado de CP. Además la presencia de tres o cuatro genes metilados estaba asociada a una supervivencia inferior en los pacientes. Ello sugiere que la metilación de varios genes supresores de tumor podría conferir un fenotipo más agresivo. Es de destacar que la metilación concomitante en P16 y BIK en pacientes afectos de MM tenía un impacto más adverso en la SG que roza la significación como factor pronóstico independiente. Éste hecho apoyaría la hipótesis de que la metilación de determinados genes supresores de tumor podría tener un papel importante en la supervivencia de determinados clones de CP porque serían resistentes al tratamiento.

Multiple Myeloma is a hematologic neoplasm included in the called plasma cell (PC) dyscrasias. In most of the cases the disease is preceded by an asymptomatic premalignant entity, the MGUS, an intermediate stage called Smoldering Multiple Myeloma (SMM) has also been described. Only some of the MGUS progress to MM, but the reason is unknown. The research of progression markers in MM has brought to the incorporation of some clinical variables in stratification guides as monoclonal component levels, free light chain type and PC percentage and atypia. However, due to the heterogeneity of the MM, there is no clear progression marker, specifically in the context of MGUS to MM progression. Promoter methylation of tumour suppressor genes could lead to an inactivation and could have an effect in the progression and/or evolution of the disease. Global methylation studies in MM have observed an increase in the methylation of some of these genes all along the evolution of the disease. For that reason, changes in methylation pattern of some genes could help into a better comprehension of the evolution of the disease.

In this study the presence of promoter methylation in tumour suppressor genes CDH1, P15, P16 and BIK has been analysed in 103 patients of MM, SMM or MGUS. The frequency of methylation has been compared between asymptomatic stages and MM, as well as in MM patients at diagnostic or in the follow up of the disease. Additionally, the relation between methylation of these genes and clinical variables has been evaluated in order to observe a possible implication in the prognosis. Methylation analysis has been done by MS-PCR with DNA obtained from bone marrow cell culture after fixation with Carnoy. Only methylation frequencies in P15 and P16 showed significant differences between asymptomatic stages and MM, however, they did not show a correlation with adverse prognosis variables. In relation to methylation and the evolution of the disease, a tendency to a greater BIK methylation frequency in the follow up MM patients compared to the diagnostic patients was observed. Likewise, the presence of BIK gene methylation in refractory samples of four patients which didn’t showed methylation in a previous study, could suggest that methylation of certain genes could play a role in the progression of drug resistant PC clones. In the analysis of the relation between clinical variables and methylation, just a correlation of P15 methylation and high levels of LDH as well as a correlation of P16 methylation and high levels of b2-microglobulin and CP were found. This results were observed only in the total of the series but not when only MM patients were analysed. In overall survival analysis, the presence of methylation in three or more genes showed lower survival than the rest of the group, which would suggest that hypermethylation could confer a more aggressive phenotype. A tendency to a lower survival was observed in refractory or relapsed patients which showed methylation in P16. The combined methylation in P16 and BIK had an adverse impact on overall survival in MM patients that was near the significance when was studied as an independent prognosis factor. This result would sustain the hypothesis that methylation in certain genes could have an important paper in the survival of some PC clones resistant to treatment.