Developing strategies for systems metabolic engineering of Pichia pastoris

Abstract

Pichia pastoris s’ha convertit en una de les plataformes cel·lulars més utilitzades per a la producció de proteïnes recombinants i metabòlits d’alt valor afegit. En els darrers anys s’han aconseguit fites importants en l’anàlisi quantitativa a nivell de sistemes de la seva fisiologia. Aquesta gran quantitat d’informació ha permès desenvolupar models metabòlics a escala genòmica, que permeten el desenvolupament de noves estratègies per l’enginyeria de soques i de bioprocés. Amb anterioritat a aquest estudi s’havien publicat tres models metabòlics a escala genòmica per a P. pastoris. No obstant això, aquests models presentaven algunes inconsistències en algunes vies metabòliques, en la nomenclatura de metabòlits i reaccions, així com les anotacions associades a certes vies. A més, algunes de les rutes metabòliques o característiques específiques de P. pastoris eren representades de forma errònia o incompleta. És per això que en aquest estudi es desenvolupa un model metabòlic a escala genòmica consens, que integra els models anteriors. A més, també es fa una revisió exhaustiva de diverses rutes metabòliques i nombroses vies es corregeixen i actualitzen d’acord amb les publicacions disponibles. Com a resultat, el nou model, iMT1026, pot reproduir amb més precisió els paràmetres de creixement experimentals de cèl·lules creixent en glucosa i diferents nivells de disponibilitat d’oxigen. Amb la voluntat d’expandir les capacitats del model, es generen noves dades fisiològiques fent servir dos dels substrats més importants per aquesta factoria cel·lular. Es realitzen unes series de cultius en continu per a la caracterització del perfil fisiològic de P. pastoris creixent en glicerol i metanol com a fonts úniques de substrat. A més, també es caracteritza la composició macromolecular de la biomassa. Posteriorment, s’incorporen en el model noves equacions de biomassa específiques per a cada font de carboni. Aquestes noves dades experimentals han permès estimar els paràmetres energètics associats a les fonts de carboni i validar el model (iMT1026 v3.0) per aquestes condicions de creixement. Tot i la validació de iMT1026 v3.0 en un rang més ampli de condicions, en aquest treball es prova en dues aplicacions diferents: en l’anàlisi de fluxos metabòlics basat en 13C i com a eina de suport per a la interpretació de resultats en soques amb modificades en el metabolisme redox. Tot i que hi ha un únic estudi on s’analitza la relació entre fluxos metabòlics en cèl·lules creixent en glicerol, no es té constància de cap estudi d’anàlisi de fluxos metabòlics en aquesta font de carboni. Així doncs, es redueix el model metabòlic a escala genòmica a un model del metabolisme central i es fa servir per a l’anàlisi de fluxos metabòlics basats en 13C en cèl·lules creixent amb glicerol a diferents velocitats de creixement. Els resultats obtinguts són molt consistents amb els cultius previs en glicerol. També s’utilitza iMT1026v3.0 com a suport per a la interpretació del perfil fisiològic obtingut en soques amb el metabolisme redox modificat. Una soca que expressa un fragment d’anticòs es modifica genèticament mitjançant l’expressió d’una NADH quinasa, de manera que el balanç de cofactors redox queda pertorbat. Les soques generades mostren una producció de proteïna recombinant més elevada i una alteració en el perfil macroscòpic de creixement. Mitjançant l’anàlisi in silico dels perfils fisiològics resultants, es prediuen possibles canvis metabòlics associats a l’alteració del balanç de cofactors que estan d’acord amb el perfil macroscòpic observat. Així doncs, en línies generals, en aquest treball es desenvolupa una eina precisa per a l’enginyeria de sistemes metabòlics. A més, és validada en condicions vàries i s’utilitza en dues aplicacions diferents que demostren la seva fiabilitat.

Pichia pastoris has become one of the most extensively used platform cell factories for recombinant protein and high-value added metabolite production. In the past recent years, important breakthroughs in the systems-level quantitative analysis of its physiology have been achieved. This wealth of information has allowed the development of genome-scale metabolic models, which make new approaches possible for host cell and bioprocess engineering. Previous to this work, three different genome-scale metabolic models were available for P. pastoris. Nevertheless, these models showed some inconsistencies regarding certain pathways, including the terminology for both metabolites and reactions and annotations. Furthermore, some P. pastoris specific metabolic traits were misrepresented. Therefore, in this study, a consensus genome-scale metabolic model has been developed, thereby integrating the prior models. In addition, a comprehensive revision of metabolic pathways was performed and several pathways were curated and updated according to the currently available literature. As a result, the new model, iMT1026, is able to more accurately reproduce experimental growth parameters using glucose as carbon source and different oxygen availability conditions. In order to expand the capabilities of the consensus model, new physiological datasets of cells growing on two of the most relevant substrates for this cell factory were generated. Specifically, a series of chemostat cultivations were performed to characterise the physiologic profile and macromolecular biomass composition of P. pastoris growing on glycerol and methanol as sole carbon sources. Also, macromolecular biomass composition was analysed, allowing us to incorporate new carbon-source specific stoichiometric biomass equations into the model, as well as to estimate the associated energetic parameters. Overall, a new version of the model (iMT1026 v3.0) was validated for these growing conditions. In addition to the validation of iMT1026 v3.0 for a wider range of carbon sources and growth conditions, we have further tested its performance in two different applications, namely, the generation of reduced metabolic models suitable for 13C-based metabolic flux analysis and, assisting the interpretation of physiological growth parameters of redox-cofactor engineered strains. In particular, the genome-scale metabolic model has been reduced into a core model and used for 13C-based metabolic flux analysis of cells growing on glycerol at different growth rates. To our knowledge, this is the first study ever reported of 13C-MFA using glycerol as sole carbon source. Notably, flux analyses are highly consistent with pioneering 13C-based metabolic profiling studies of P. pastoris growing on glycerol. iMT1026 v3.0 was also employed for assisting the interpretation of the physiological profiles obtained for redox-cofactor engineered strains. A recombinant strain producing an antibody fragment was engineered to overexpress a heterologous NADH kinase, aiming at increased NADPH regeneration rates. Notably, the redox-engineered strains showed an increase in recombinant protein production and altered macroscopic growing profiles. In silico analysis of the impact of NADH kinase overexpression using the iMT1026 model predicted possible metabolic changes associated to the redox cofactor imbalance that were in agreement with the observed physiological phenotypes. Overall, a refined tool for systems metabolic engineering is provided in the present study. Moreover, such tool has been validated for a wide range of environmental conditions and employed in two different applications, confirming its reliability.