Polimorfismes genètics i tractament antitumoral: evolució dels pacients amb leucèmia limfoblàstica aguda i inducció de leucèmies secundàries

Abstract

Els pacients amb la leucèmia limfoblàstica aguda (LLA) infantil responen diferentment a la quimioteràpia. Els polimorfismes genètics, juntament amb les alteracions genètiques en les cèl·lules leucèmiques, podrien ser responsables de la variabilitat en aquesta resposta. En la present tesi es va estudiar l’associació de copy number variants i/o single nucleotide polymorphisms (SNPs) en gens que codifiquen enzims metabolitzadors de fàrmacs i proteïnes apoptòtiques (CYP2D6, GSTT1, GSTM1, SULT1A1, UGT2B17 i TP53) amb l’evolució dels pacients amb LLA infantil. Es va observar que els pacients amb el genotip GSTM1 non-null mostraven una supervivència inferior i que els pacients portadors d’almenys un al·lel amb la variant Pro del polimorfisme Arg72Pro de TP53 també mostraven una tendència a una supervivència inferior. A més, la combinació d’ambdós genotips va resultar en una major reducció de la supervivència, comparat amb GSTM1 per si sol. Per avaluar la base biològica d’aquests resultats, es va dissenyar un model in vitro amb cèl·lules leucèmiques Jurkat transfectades amb l’al·lel Arg o Pro de TP53 i amb un siRNA de GSTM1. Els resultats van mostrar que les cèl·lules Jurkat p53Arg GSTM1 null tenien una sensibilitat més gran a un fàrmac antitumoral glucocorticoide, la dexametasona, confirmant els resultats observats en els pacients. S’ha descrit que GSTM1 inhibeix la mort cel·lular induïda per glucocorticoides, i p53Arg indueix l’apoptosi més eficientment que p53Pro, la qual és més eficient en activar l’aturada del cicle cel·lular i la reparació del DNA. Per tant, tenir almenys una còpia del gen GSTM1 i p53Pro, suficient en heterozigosi, podria conduir a una apoptosi menys eficaç en les cèl·lules leucèmiques després del tractament antitumoral i per tant, podria relacionar-se amb una menor supervivència dels pacients amb LLA. Per altra banda, una de les complicacions més greus després de la teràpia antitumoral és el desenvolupament d’un càncer secundari, generalment una neoplàsia mieloide (t-NM). Fins un 20% dels pacients tractats per un càncer primari poden desenvolupar una t-NM. És probable que les variacions genètiques constitucionals estiguin implicades en el risc individual de desenvolupar un càncer secundari. En la present tesi es va analitzar l’impacte de dos polimorfismes en gens de la via de p53 en el desenvolupament de t-NM i es va observar que la variant p53Pro de l’SNP Arg72Pro de TP53 i l’al·lel G de l’SNP309 de MDM2 estaven sobrerepresentats en pacients amb t-NM comparat amb els controls. Per analitzar el possible efecte biològic del polimorfisme de TP53, es va desenvolupar un model amb línies cel·lulars Jurkat isogèniques, que expressaven p53Arg o p53Pro. Després del tractament amb un agent alquilant o un inhibidor de la topoisomerasa II es van avaluar els següents paràmetres: dany en el DNA, nombre de cèl·lules apoptòtiques i formació d’alteracions cromosòmiques característiques de t-NM després d’un cultiu cel·lular a llarg termini. Les cèl·lules Jurkat p53Arg van presentar més foci de γ-H2AX per cèl·lula, un nivell més elevat de dany en el DNA i un potencial apoptòtic més elevat, respecte a les p53Pro. A més a més, es va detectar la translocació t(15;17) i la deleció en 5q33 en les cèl·lules p53Pro, però no en les p53 Arg. Per això, s’ha proposat que les diferències en el risc de desenvolupar t-NM en pacients tractats amb les mateixes dosis de quimioteràpia i/o radioteràpia serien degudes a la capacitat de cada individu de dur a terme més o menys eficientment l’apoptosi o la reparació de les lesions al DNA, segons el polimorfisme que tingui a TP53.

Children with acute lymphoblastic leukemia (ALL) respond differently to chemotherapy. Genetic polymorphisms together with genetic abnormalities in leukemic cells are probably behind variability in response to chemotherapy in childhood ALL. In the present thesis, we investigated whether copy number variants and/or single nucleotide polymorphism (SNPs) in genes coding for proteins involved in drug metabolism or apoptosis (CYP2D6, GSTT1, GSTM1, SULT1A1, UGT2B17 and TP53) have an impact on the therapeutic outcome of childhood ALL. We observed that patients with GSTM1 non-null genotype showed poor survival and patients carrying at least one allele of the Pro variant of the TP53 Arg72Pro SNP also showed a tendency to poor survival. When combining GSTM1 and TP53 genotypes, our data indicated that they can predict survival with higher significance than GSTM1 alone. To validate these results, an in vitro model was created with leukemic Jurkat cell line by transfection of the two TP53 variants at codon 72, either Pro or Arg and a GSTM1 siRNA into Jurkat cells. Results revealed that Jurkat p53Arg GSTM1 null cells exhibited higher sensitivity to dexamethasone, confirming the results observed in patients. It has been reported that GSTM1 inhibits glucocorticoids-induced cell death and that p53Arg induces apoptosis more efficiently than p53Pro, which is a more efficient activator of cell cycle arrest and DNA damage repair. Therefore, at least one copy of the gene GSTM1 and p53Pro, enough in heterozygosis, would lead to less efficient apoptosis in leukemic cells after the antileukemic treatment and could therefore be related to lower survival. On the other hand, one of the most severe complications after successful cancer therapy is the development of a secondary cancer, mostly a myeloid neoplasm (t-MN). Up to 20% of patients treated for a primary cancer develop t-MN. Constitutional genetic variation is likely to impact on an individual’s risk of developing t-MN. In the present thesis, we analyzed the impact of two polymorphisms in the p53 pathway on the development of t-MN. Results revealed that the TP53 Arg72Pro polymorphism and the MDM2 SNP309 were associated with t-MN risk. The p53Pro and the G allele of MDM2 were overrepresented in t-MN patients. To assess the biological effect of the TP53 polymorphism, we established Jurkat isogenic cell lines expressing p53Arg or p53Pro and assessed the number of γ-H2AX foci, chromosome alterations, sister chromatid exchanges, and apoptotic cells, as well as development of chromosomal alterations typical of t-MN, after treatment with an alkylating agent, or a topoisomerase II poison. Jurkat p53Arg cells presented more γ-H2AX foci per cell, higher level of DNA damage and higher apoptotic potential than p53Pro cells. Moreover, Jurkat p53Pro cells presented the t(15;17) translocation and 5q33 deletion whereas Jurkat p53Arg cells did not present the alterations. Therefore, it could be possible that differences in t-MN risk in patients treated with the same doses of chemotherapy and/or radiation are due to the ability of individuals to undergo apoptosis or to repair DNA lesions more or less efficiently related to the TP53 polymorphism.