Effects of neuromuscular activity coupled to BDNF/TrkB signaling on the phosphorylation of the exocytotic proteins Munc18-1 and SNAP-25 through nPKCε and cPKCβI

Abstract

A la sinapsis de la unió neuromuscular (NMJ), diverses vies de senyalització coordinen les respostes pre-/postsinàptiques i les cèl·lules glials associades. La relació entre aquestes vies modula les vesícules sinàptiques que regulen la neurotransmissió. A més, la PKC fosforila diverses molècules de l'aparell exocitòtic responsable d'aquesta regulació. Munc18-1 i SNAP-25 són substrats de PKC que juguen un paper clau en la maquinària exocitòtica. A més, la PKC està modulada per l'activitat pre-/postsinàptica al múscul esquelètic. No obstant això, encara es desconeix quines isoformes de PKC regulen aquestes molècules clau en la NMJ. cPKCβI i nPKCƐ es troben exclusivament en el terminal nerviós de la NMJ i estan regulades per l'activitat sinàptica. A més, la contracció muscular a través de BDNF/TrkB té un impacte important en aquestes isoformes. Amb tot, l’objectiu d’aquesta tesi és determinar l’expressió, localització i regulació pels activadors de PKC calci i èsters de forbol (PMA) de Munc18-1 i SNAP-25 i la seva fosforilació en el múscul esquelètic. A més, estudiar si aquestes fosforilacions estan afectades per (1) activitat sinàptica i contracció muscular per se; i (2) nPKCƐ, cPKCβI i la senyalització BDNF/TrkB de manera dependent d’activitat neuromuscular. Els principals resultats, obtinguts mitjançant anàlisi Western blot i microscòpia confocal, mostren que Munc18-1 i SNAP-25 s'expressen i fosforilen en condicions basals en el múscul esquelètic, predominantment a la fracció membrana, essent Munc18-1 localitzat al terminal nerviós. La fosforilació de Munc18-1 i SNAP-25 és modulada per calci, PMA, activitat sinàptica i és promoguda per nPKCƐ. D’altra banda, cPKCβI i la senyalització BDNF/TrkB regulen la fosforilació de Munc18-1 però no la de SNAP-25. Finalment, la contracció muscular regula negativament aquestes proteïnes per assolir un estat basal. En conclusió, aquests resultats proporcionen una visió mecànica de com Munc18-1 i SNAP-25 es regulen per aconseguir l'extraordinària precisió i plasticitat de la neurotransmissió.

En la sinapsis de la unión neuromuscular (NMJ), varias vías de señalización coordinan las respuestas pre-/postsinápticas y las células gliales asociadas. La relación entre estas vías modula las vesículas sinápticas que regulan la neurotransmisión. Además, la PKC, modulada por actividad presináptica y postsináptica en el músculo esquelético, fosforila varias moléculas del aparato exocitótico responsable de esta regulación. Munc18-1 y SNAP-25 son sustratos de PKC que juegan un papel clave en la maquinaria exocitótica. Sin embargo, todavía se desconoce qué isoforma de PKC regula estas moléculas clave en la NMJ. cPKCβI y nPKCƐ se encuentran exclusivamente en el terminal nervioso de la NMJ y están reguladas por actividad sináptica. Además, la contracción muscular a través de BDNF/TrkB tiene un impacto importante en estas isoformas. Así mismo, el objetivo de esta tesis es determinar la expresión, localización y la influencia de los activadores de PKC calcio y ésteres de forbol (PMA) de Munc18-1 y SNAP-25 y su fosforilación en el músculo esquelético. Además, estudiar si dichas fosforilaciones están afectadas por (1) actividad sináptica y contracción muscular per se; y (2) nPKCƐ, cPKCβI y la señalización BDNF/TrkB de manera dependiente de actividad neuromuscular. Los principales resultados, obtenidos mediante análisis Western blot y microscopia confocal, muestran que Munc18-1 y SNAP-25 se expresan y fosforilan en condiciones basales en el músculo esquelético, predominantemente en la fracción membrana, localizándose Munc18-1 en el terminal nervioso. La fosforilación de Munc18-1 y SNAP-25 se modula por calcio, PMA, actividad sináptica y es promovida por nPKCƐ. Por otra parte, cPKCβI y la señalización BDNF/TrkB regulan la fosforilación de Munc18-1 pero no de SNAP-25. Finalmente, la contracción muscular regula negativamente estas proteínas hacia un estado basal. En conclusión, estos resultados proporcionan una visión mecánica de cómo Munc18-1 y SNAP-25 se regulan para lograr la extraordinaria precisión y plasticidad de la neurotransmisión.

At the neuromuscular junction (NMJ) synapse, several signaling pathways coordinate pre-, post-synaptic responses and associated glial cells. The relation between these signaling pathways modulates the pool of synaptic vesicles leading to neurotransmission. Moreover, PKC phosphorylates several molecules of synaptic vesicle exocytotic apparatus responsible to the regulation of neurotransmitter release. Munc18-1 and SNAP-25 are two PKC substrates that play a key role in the exocytotic machinery. In addition, PKC is modulated by presynaptic and postsynaptic activity in skeletal muscles. Nevertheless, it is still unknown which PKC regulates these key molecules in the NMJ. cPKCβI and nPKCƐ are exclusively located at the nerve terminal of the NMJ and are regulated by synaptic activity. In addition, muscle contraction through BDNF/TrkB has an important impact on these PKC isoforms. Therefore, this thesis is aimed to determine the expression, location and regulation by the PKC-activators calcium and phorbol esters (PMA) of Munc18-1 and SNAP-25 and their phosphorylated forms in the skeletal muscle. Also, to study whether Munc18-1 and SNAP-25 phosphorylation are affected by (1) synaptic activity and muscle contraction per se; and (2) nPKCƐ, cPKCβI and BDNF/TrkB signaling in a neuromuscular activity-dependent manner. Main results, obtained by Western blot analysis and confocal microscopy, show that Munc18-1 and SNAP-25 are expressed and phosphorylated in basal conditions in the skeletal muscle, predominantly in the membrane fraction, with Munc18-1 being located at the nerve terminal. Munc18-1 and SNAP-25 phosphorylation are modulated by calcium, PMA, synaptic activity and enhanced by nPKCƐ. Otherwise, cPKCβI and BDNF/TrkB signaling pathway regulates Munc18-1 but not SNAP-25 phosphorylation. Finally, muscle contraction downregulates these proteins to reach a basal state. In conclusion, these results provide a mechanistic insight into how Munc18-1 and SNAP-25 phosphorylation is regulated to achieve the extraordinary precision and plasticity of neurotransmission.